3.1.1. Основные понятия
Консервирование крови – это комплекс воздействий на нее, имеющих своей целью создание условий для длительного хранения крови вне организма в стерильном состоянии с максимальным сохранением ее биологических свойств (как форменных элементов, так и жидкой части крови).
Для консервирования крови используются два метода:
консервирование при положительных температурах;
консервирование при отрицательных температурах.
Хранение крови при положительных температурах обычно происходит в бытовых комнатных холодильниках.
Они обеспечивают поддержание температурного режима в пределах от +2 до +4°С. При таких температурах можно хранить консервированную цельную кровь, эритроцитную массу, нативную плазму.
Различные компоненты крови имеют разные сроки хранения. Так, например, эритроциты могут сохранять свои свойства в течение нескольких недель, а лейкоциты и тромбоциты – только несколько дней. Это объясняется тем, что лейкоциты и тромбоциты – ядерные клетки с более сложными функциями, а при длительном хранении в первую очередь изменения затрагивают ядро клетки. Срок хранения нативной плазмы ограничен тремя днями. Это обусловлено тем, что за это время инактивируется большая часть биологически активных веществ, входящих в ее состав.
Для того чтобы избежать таких нежелательных последствий при длительном хранении крови, используется ее консервирование при отрицательных температурах. Это позволяет увеличить срок хранения крови за счет того, что обменные процессы в клетках в значительной степени подавляются, а это препятствует раннему их "старению".
Для криоконсервирования используются следующие температурные режимы:
умеренно низкие температуры (–40...–60°С),
ультранизкие температуры (–196°С).
Величиной температуры определяются сроки, в течение которых эритроциты смогут сохранить свои свойства. При умеренно низких температурах они могут храниться несколько месяцев, а при ультранизких – 10 и более лет.
Принимая во внимание то, что ядерные клетки "стареют" быстрее, чем эритроциты, для консервирования лейкоцитов и тромбоцитов желательно использовать ультранизкие температуры, так как при умеренно низких температурах срок хранения уменьшается до нескольких недель.
3.1.2. Консервирующие растворы
Для увеличения продолжительности сроков хранения крови вне организма используют специальные растворы – гемоконсерванты.
В качестве обязательного компонента во все консервирующие растворы входят особые химические вещества – стабилизаторы. Широкое распространение в практической деятельности получили такие стабилизаторы как лимонная кислота и цитрат натрия. Они связывают ионы кальция, что способствует подавлению одного из этапов процесса гемостаза – образования тромбина.
Важным свойством цитрата натрия является то, что через 20–30 мин после трансфузии крови, стабилизированной с его помощью, он почти полностью (не менее 90%) выводится из организма.
Необходимо помнить о том, что при острой кровопотере или других состояниях (гипотермия) в результате введения стабилизированной цитратом натрия крови может возникнуть дефицит ионов кальция (см. гл. 9), поэтому после гемотрансфузии объемом в 500 мл надо внутривенно ввести 10 мл 10% раствора хлорида или глюконата кальция. Этого бывает вполне достаточно для восполнения возникающего дефицита кальция.
К другой разновидности стабилизаторов относится гепарин. Он препятствует свертыванию крови, непосредственно связывая и инактивируя тромбин. Существенным недостатком гепарина при использовании его в качестве стабилизатора является то, что он не позволяет длительно сохранять консервированную с его помощью кровь, потому что по мере увеличения срока хранения происходит инактивация гепарина. В результате этого уже через сутки образуются мелкие, а через двое суток и крупные сгустки крови.
Гепарин как консервант кроме самого гепарина (50 мг) содержит глюкозу (5 г), изотонический раствор хлорида натрия (до 100 мл). У этой смеси рН=7,3. Соотношение "раствор – кровь" при консервации должна быть 1:9. Такой метод стабилизации крови используется в случае необходимости ее срочного применения. Так, гепаринизированная кровь получила применение при проведении операций с использованием аппаратов искусственного кровообращения – ею заполняют аппарат.
При заготовке крови обычно используются следующие гемоконсерванты:
Глюкозоцитратный раствор глюгицир – это гемоконсервант ЦОЛИПК-7б без левомицетина. В его состав входят:
| цитрат натрия | – 2 г; |
| безводная глюкоза | – 3 г; |
| бидистиллированная вода | до 100 мл. |
У глюгицира рН=5,0. Он стерилизуется в автоклаве при температуре +120°С в течение 30 мин. Срок хранения 2 года. Для достижения устойчивой стабилизации крови соотношение ее объема и объема консерванта должно составлять 4:1.
Гемоконсервант Л-6 – кислый глюкозоцитратный раствор с сульфацилом натрия, в состав которого входят:
| цитрат натрия кислый | – 2,5 г; |
| глюкоза | – 3 г; |
| сульфацил натрия | – 0,5 г; |
| трипафлавин нейтральный | – 0,025 г; |
| бидистиллированная вода | до 100 мл. |
Гемоконсервант Л-6 имеет рН, равный 4,9. Этот раствор стерилизуется в автоклаве при температуре +120°С в течение 30 мин. Срок хранения 7 дней.
Раствор цитроглюкозофосфата, в состав которого входят:
| лимонная кислота | – 1 г; |
| безводная глюкоза | – 3 г; |
| трехзамещенный фосфат натрия | – 0,75; |
| 4% раствор NaOH | (до рН=5,5-5,9); |
| бидистиллированная вода | до 100 мл. |
рН данного раствора равен 5,7. Цитроглюкозофосфат стерилизуется в автоклаве при температуре +106°С в течение 45 мин. Если раствор изготовлен в заводских условиях, то срок его хранения может быть до 2 лет.
Заготовка крови с помощью раствора цитроглюкозофосфата предпочтительнее, так как повышение рН раствора до 5,7 обеспечивает более высокую концентрацию ионов водорода консервированной крови во время ее хранения (рН консервированной крови повышается до 7,2). Кроме того он содержит меньше анионов лимонной кислоты, что уменьшает опасность развития цитратной интоксикации (см. гл.9). Также в растворе цитроглюкозофосфата медленнее разрушаются фосфатные соединения. За счет этого сохраняется на достаточно высоком уровне кислородно-транспортная функция эритроцитов.
Кровь, заготовленную с помощью вышеперечисленных гемоконсервантов, можно переливать в течение 21 дня хранения. Однако целесообразнее, особенно у тяжелобольных со значительными нарушениями гомеостаза, использовать ее в первые 7 дней после заготовки (приживаемость перелитых эритроцитов после непродолжительных сроков хранения значительно выше).
При заготовке крови для экстракорпорального кровообращения в последние годы с успехом применяют гемоконсервант ЦОЛИПК-12а следующего состава:
| лимонная кислота | – 1,5 г; |
| Глюкоза | – 6 г; |
| фосфат натрия трехзамещенный | – 0,2 г; |
| 4% раствор NaOH | до рН=6,3; |
| вода бидистиллированная | до 100 мл. |
Кровь заготовленная с помощью этого раствора, обладает наиболее оптимальными параметрами для заполнения аппарата искусственного кровообращения. Она имеет преимущества перед кровью, консервированной с помощью других растворов, вследствие меньшего количества анионов лимонной кислоты, а для нейтрализации их избытка требуется незначительное количество хлорида кальция, в результате чего устраняется возможность развития гиперкальциемии у реципиента. Кровь, стабилизированную консервантом ЦОЛИПК-12а, имеет самый высокий уровень рН, поэтому она более длительно сохраняет кислородно-транспортную функцию. По основным свойствам в первые 4–5 дней хранения эта кровь почти не отличается от свежезаготовленной. За счет этого такая кровь может быть использована в эти дни для экстракорпорального кровообращения.
В процессе хранения консервированная кровь претерпевает многочисленные изменения. В первую очередь изменения затрагивают клеточные элементы крови. Так, постепенно меняется форма эритроцитов – из дискоидной в шаровидную, а в дальнейшем в сферическую. Но изменения не ограничиваются только внешней стороной – одновременно с этим происходит изменение биохимических и физико-химических свойств эритроцитов.
Полноценность консервированной крови определяется уровнем макроэргических фосфатов в ней. Поэтому применяются такие гемоконсерванты, которые способны поддерживать уровни АТФ и 2,3-ДФГ, так как они отвечают за поддержание жизнеспособности эритроцитов и сохранение кислородно-транспортной функции гемоглобина соответственно.
Как только кровь покинула сосудистое русло донора и была стабилизирована и консервирована, начинаются необратимые процессы "старения" крови. Постепенно происходит снижение физиологической полноценности эритроцитов, в первую очередь страдает их кислородно-транспортная функция. Вторые сутки знаменуются утратой физиологической полноценности лейкоцитов и тромбоцитов, разрушением антигемофильного глобулина. Неделю спустя начинают гибнуть лимфоциты и укорачивается полупериод жизни эритроцитов. С середины третьей недели хранения начинается спонтанный гемолиз эритроцитов.
3.2.1. Общие сведения
Цельная кровь при положительных температурах (+2...+6°С) может сохраняться в течение ограниченного периода времени. При использовании раствора глюгицира потеря функциональной активности клетками крови происходит к концу третьей недели хранения в результате истощения содержания ферментов и коферментов, ответственных за поддержание метаболических процессов. А при условии добавления метаболитов углеводно-фосфорного обмена срок сохранения полноценных эритроцитов удлиняется до 30–35 дней. При этом по мере увеличения срока хранения ухудшаются морфофункциональные свойства эритроцитов. Поэтому был разработан метод хранения эритроцитов при ультранизких температурах, позволяющий сохранять клетки крови в биологически полноценном состоянии в течение многих лет. Для предотвращения гибели или повреждения клеток при замораживании к ним в определенных соотношениях добавляются специальные химические агенты, так называемые криопротекторы, или криофилактики, а сам метод получил название криоконсервирования.
Криопротекторы в зависимости от механизма ограждающего действия на клетки делят на две группы:
эндоцеллюлярные (т.е. проникающие внутрь клетки);
экзоцеллюлярные (т.е. не проникающие внутрь клетки).
Криопротектором первой группы является глицерин. В силу того, что он быстро проникает в эритроциты, его широко применяют для криоконсервирования эритроцитов. Механизм его защитного действия еще окончательно не изучен, но уже сейчас можно говорить о том, что глицерин влияет на процессы как внутриклеточной, так и внеклеточной кристаллизации, отдаляя и замедляя ее наступление по мере понижения температуры. Он также оказывает структурирующее влияние на внутриклеточную воду.
У глицерина есть один существенный недостаток – он является гиперосмолярным веществом по отношению к плазме крови. Из-за этого эритроциты, замороженные с ним, нельзя сразу после оттаивания переливать больному или помещать в любую изотоническую среду, поскольку глицери-низированные эритроциты начинают притягивать на себя воду из плазмы, быстро увеличиваются в объеме, теряют стойкость и разрушаются, т.е. имеет место так называемый осмотический шок, или осмотический гемолиз. Поэтому криоконсервированные в глицерине эритроциты перед трансфузией больному подвергаются специальной обработке – отмыванию.
3.2.2. Методы замораживания эритроцитов
В клинической практике для консервирования эритроцитов крови человека используют два основных метода замораживания:
быстрое – со скоростью охлаждения несколько градусов в секунду,
медленное – со скоростью снижения температуры несколько градусовв минуту.
Есть еще и третий метод замораживания – это так называемое ультрабыстрое замораживание. При этом методе скорость охлаждения достигает 100° в секунду. Но он не получил применения в клинической практике из-за того, что достаточно большие объемы крови (250–500 мл) замораживать таким образом просто невозможно.
Поэтому более подробно остановимся на основных методах замораживания эритроцитов.
3.2.2.1. Быстрое замораживание эритроцитов
В настоящее время замораживание, хранение и отмывание эритроцитов перед их введением больному осуществляется в отделениях долгосрочного хранения крови (банках крови), располагающих для этого соответствующей аппаратурой и штатами.
Первым этапом является заготовка крови. Кровь от доноров заготавливают во флаконы емкостью 250 и 500 мл или в пластиковые контейнеры, содержащие консервант. Как правило, замораживанию подвергается кровь со сроком хранения 2–3 дня. Кровь более поздних сроков хранения, а также свежую кровь замораживать не желательно.
Вторым этапом является разделение жидкой и клеточной частей крови. Плазму отсасывают и используют для переливания или приготовления препаратов крови. Эритроциты же смешивают с криоконсервантом в соотношении 1:1. Обычно используется консервант следующего состава:
| Маннит | – 40 г; |
| хлорид натрия | – 7 г; |
| Nа2НРО? 12Н2О | – 0,3 г; |
| глицерин (отн. пл. 1,248) | – 300 мл; |
| вода бидистиллированная | до 1000 мл. |
Третий этап – смешивание эритроцитов с криофилакти-ком. Оно производится путем медленного добавления его во флакон или пластикатный контейнер с эритроцитами при постоянном помешивании. Это необходимо для постепенного и равномерного смешивания глицерина с эритроцитами. Добавление же эритроцитов в криоконсервант категорически не допускается, так как это ведет к развитию гемолиза.
На четвертом этапе эритроциты, смешанные с криофи-лактиком, помещаются в специальные контейнеры. Они представляют собой емкости из дюралюминия объемом 250 мл. Их особенностью является наличие гофрированных стенок. Такая форма позволяет увеличить поверхность соприкосновения с окружающей средой, а это в свою очередь позволяет ускорить теплоотвод при замораживании и увеличить приток тепла при оттаивании эритроцитов. Одна доза замороженных эритроцитов по объему составляет 125 мл.
Для герметизации контейнеров применяются специальные тефлоновые колпачки. Использование этого материала оправдано тем, что он является инертным в химическом отношении, а так же тем, что при охлаждении его объем уменьшается в большей степени, чем у дюралюминия, и тем самым достигается полная герметизация контейнера. Это абсолютно необходимо, потому что если в негерметичный контейнер попадет жидкий азот, то при размораживании резкое увеличение объема газа в контейнере приведет просто-напросто к его взрыву.
После смешивания эритроцитов с ограждающим раствором необходимо выждать не менее 15 мин и только после этого переходить к замораживанию. Это время требуется для полного проникновения глицерина в эритроциты. Если это будет меньше требуемого, то большинство эритроцитов погибнет при замораживании–оттаивании. Одинаково нежелательно и увеличение времени выжидания, так как это повышает вероятность проявления токсических эффектов глицерина в отношении эритроцитов, которые возникают при комнатной температуре. В результате этого большинство эритроцитов может быть повреждено или гемолизировано еще до начала процесса замораживания.
Герметизированные контейнеры маркируются – на них пишется номер, Ф.И.О. донора, группа крови по системе АВ0 и резус-фактору. После этого данный контейнер регистрируется в специальном журнале – все данные с этикетки на флаконе крови, которая замораживается, переписываются в него. Также в этом журнале указывается дата замораживания.
Пятый этап – собственно замораживание. Этот процесс осуществляется в специальной емкости, наполненной жидким азотом. При проведении замораживания емкость постоянно покачивается. Весь процесс охлаждения от +20...+25 до –196°С занимает около 2 мин. После окончания замораживания емкость открывается и контейнеры с помощью специальных щипцов быстро перемещаются в сосуд Дьюара, также содержащий жидкий азот. Емкость этого сосуда составляет 5 л. После завершения замораживания всей партии сосуд Дьюара подносят к хранилищу биопродуктов и помещают в него контейнеры с эритроцитами. Над каждым хранилищем имеется схема расположения контейнеров и в свободную ячейку (куда помещается контейнер) вписывается карандашом его регистрационный номер.
Процесс размораживания происходит следующим образом. Когда возникает необходимость в размораживании контейнера, его специальными щипцами извлекают из ячейки хранилища биопродуктов, помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом и подносят к емкости для размораживания. Она представляет собой металлический сосуд, снабженный элементами для нагревания воды и терморегулятором, который отключает элементы при достижении температуры +45°С. Эта емкость также снабжена устройством для ее постоянного покачивания. Отогрев контейнеров от –196 до +4°С осуществляется за 23–25 с. Достигать более высокой температуры при оттаивании нежелательно из-за возможности нарастания степени гемолиза.
3.2.2.2. Отмывание эритроцитов (деглицеринизация)
Как уже говорилось выше, эритроциты, консервированные с глицерином, нельзя сразу же после оттаивания переливать в сосудистое русло. Предварительно необходимо провести их деглицеринизацию. Этот процесс сводится к отмыванию оттаявших эритроцитов гиперонкотическими растворами с понижающейся концентрацией. В результате добиваются снижения уровня глицерина в клетках до 0,3–0,45%, что делает безопасным введение таких эритроцитов в сосудистое русло реципиента.
Существует несколько методов проведения процесса отмывания эритроцитов:
обратимая цитоагломерация;
непрерывное центрифугирование на фракционаторах или сепараторах крови;
серийное центрифугирование.
Наиболее часто в практике используется метод серийного центрифугирования.
Технически этот процесс осуществляется следующим образом:
Приготовление одной дозы эритроцитов методом серийного центрифугирования требует использования 1150 мл растворов. Ресуспендирование эритроцитов можно проводить на растворах ЦОЛИПК-8в, гемодезе, реополиглюкине, альбумине или других.
На флакон с взвесью криоконсервированных эритроцитов наклеивается этикетка, на которой кроме обязательных данных о доноре, группе крови по системе АВ0 и резус-принадлежности указывается срок хранения эритроцитов, после которого переливание их реципиенту крайне не желательно.
Срок хранения размороженных эритроцитов при температуре +4±2°С колеблется от 1 до 3 недель, но большинство авторов рекомендует использовать их в течение трех первых суток.
3.2.2.3. Замораживание эритроцитов при умеренно низких температурах
Как уже говорилось ранее, для медленного замораживания эритроцитов используют холодильники различной конструкции с разным объемом замораживающей камеры. Они должны удовлетворять требованию по поддержанию температурного режима в пределах –40...–80°С. Для замораживания эритроцитов в холодильнике используют пластиковые контейнеры емкостью 500 мл. Данная методика позволяет довести конечное содержание глицерина в растворе до 40%. Поэтому при добавлении ограждающего раствора требуется известная осторожность с целью предупреждения осмотической травматизации эритроцитов. Криоконсервант и эритроциты при смешивании должны быть комнатной температуры. Время выжидания (эквилибрационный период) перед помещением контейнера в холодильник при использовании данной методики увеличивается до 30 мин. После этого контейнер в горизонтальном положении помещается в морозильную камеру.
Размораживание эритроцитов, замороженных по данной методике осуществляется в водяной бане при температуре +37°С при постоянном покачивании. Весь процесс оттаивания длится 6–8 мин.
Учитывая то, что концентрация глицерина в смеси более чем в 2,5 раза превышает таковую при замораживании эритроцитов в жидком азоте, процесс деглицеринизации носит более сложный характер.
Сначала в контейнер добавляют 12% раствор хлорида натрия, а после центрифугирования и отсасывания надоса-дочной жидкости отмывание производится еще трижды 1,6% растворами хлорида натрия с добавлением буфера. Отмытые таким образом эритроциты ресуспендируют в равном объеме плазмозамещающего раствора.
Замораживание эритроцитов при умеренно низких температурах обладает рядом существенных преимуществ перед быстрым замораживанием. Во-первых, криоконсервированные таким образом эритроциты дешевле. Во-вторых, данная методика более проста в техническом плане. В-третьих, она безопасна.
Эритроциты, замороженные при умеренно низких температурах и в жидком азоте, после деглицеринизации хранятся и используются одинаково.
3.2.3. Применение криоконсервированных эритроцитов в клинике
Показания к назначению размороженных эритроцитов аналогичны таковым при назначении нативной эритровзвеси или нативных отмытых эритроцитов. Но при этом надо учитывать целый ряд преимуществ, которыми обладает взвесь размороженных эритроцитов. Первым и основным преимуществом является то, что в процессе криоконсервирования и деглицеринизации из взвеси эритроцитов удаляются все другие клеточные элементы крови, вазоактивные вещества, калий и антикоагулянты, входящие в состав гемоконсерванта. Кроме того, в отмытой эритровзвеси остаются наиболее устойчивые эритроциты, потому что старые и нестойкие эритроциты полностью удаляются на этапах подготовки к трансфузии.
Вторым важным преимуществом является то, что из взвеси размороженных эритроцитов в процессе отмывания практически полностью удаляются вирусы гепатита В, а также ни А ни В. Причем, чем больше кратность отмывания, тем меньше вероятность заражения реципиента этой инфекцией при переливании ему размороженной эритровзвеси.
Третье преимущество состоит в том, что размороженные эритроциты практически лишены аллергизирующих свойств, так как основные иммунизирующие факторы удаляются в процессе отмывания.
Противопоказания для переливания криоконсервированных эритроцитов те же, что и для нативных.
Переливание размороженных эритроцитов осуществляется через систему с фильтром с обязательным выполнением всех проб на совместимость и трехкратной биологической пробы. После переливания взвеси из размороженных эритроцитов за больными необходимо наблюдение в течение 3 ч для предупреждения развития возможных побочных реакций (термометрия и общий анализ мочи). По мнению большинства авторов, реакции при переливании криоконсервированных эритроцитов регистрируются в несколько раз реже, чем при переливании нативных эритроцитов.