Статья готовится к печати ...

Обнаружение маркеров микроорганизмов в составе жирных кислот биологических жидкостей урогенитального тракта и исследование их диагностической значимости

Осипов Г.А., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Крымцева Т.А, Радюшина Т.В., Осипов Д.Г.

Академическая группа Академика РАМН Ю.Ф.Исакова

ВНИИ биологического приборостроения

Москва, Россия

 

Методом газовой хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией (ГХ-МС) изучен состав жирных кислот (ЖК), оксикислот и альдегидов, входящих в состав липидов биологических жидкостей урогенитального тракта (УГТ) мужчин и женщин. Предпринята попытка на превалирующем фоне липидных компонентов организма человека выявить специфические химические компоненты (маркеры ) микроорганизмов (без предварительной инкубации пробы), колонизирующих и инфицирующих эти органы, и соотнести их с их конкретными родами и видами. При этом привлечены известные сведения о синтезе жирных кислот клетками микроорганизмов и человека, известные из литературных данных. Характер статистических изменений концентраций жирных кислот в 500 пробах биологических жидкостей УГТ показывает, что вещества предположительно микробного происхождения имеют более широкий диапазон количественных изменений, выходящий за пределы значений, характерных для здоровых людей, при различных патологиях УГТ и коррелирующие в ряде случаев с диагнозом заболевания или данными традиционного бактериологического обследования. Количество ЖК микробного происхождения колеблется от 0,1 до 10000нГ/мл в зависимости от вещества и состояния микробного ценоза локуса (норма или воспалительный процесс). Для измерения малых концентраций микробных маркеров на превалирующем фоне компонентов биологической жидкости разработан метод подготовки пробы и анализа методом ГХ-МС в режиме селективных ионов (масс-фрагментографии). Предложен способ определения концентраций отдельных микроорганизмов ценоза УГТ по данным качественного и количественного анализа состава микробных маркеров, основанный на методологии определения родового (видового) состава микробных сообществ, разработанной нами ранее для экологических проб. Достоверность отнесения данных маркерного анализа подтверждена отличием состава микроорганизмов УГТ в норме и патологии, корелляцией с клиникой патологических отклонений, уменьшением (до нуля или нормального значения) концентраций маркеров патогенов в результате лечения антибиотиками, а также адекватностью состава микроорганизмов УГТ, определенного методом маркеров и культурально-биохимическим (по литературным данным). Предложенный метод оценки состояния биоза УГТ по данным анализа химических маркеров микроорганизмов может быть перспективным вследствие его экспрессности (определение всех маркеров в одном цикле анализа за 5 часов), прямой количественной связи концентрации маркера с количеством микроорганизмов, отсутствия необходимости культивирования пробы, независимость от физиологических, биохимических и прочих факторов, препятствующих традиционной диагностике ряда микроорганизмов.

ВВЕДЕНИЕ

Состав основных высших жирных кислот мочи, вагинальной жидкости женщин и семени мужчин известен [ 1-3, и ссылки] и содержит, как и другие жидкости и ткани человека, четные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с числом углеродных атомов от 12 до 26 (С12-С26). Из нечетных ЖК обнаружены пента- и гептадекановые в минорных количествах (1-2%), а также С25. Состав липидных компонентов семени недавно опубликован в работе Lenzi и соавторов [4] (Lenzi, Нum.Reprod.Update). Там же приведен ретроспективный обзор собственных и литературных данных и приведены заключения о связи состава липидов и свойств подвижности и реактивности сперматозоидов. Как оказалось соотношение полиненасыщенных и прямоцепочечных ЖК С12-С15 резко уменьшается при азооспермии, что может служить диагностическим признаком [5](Nissen,1981).

В предлагаемой работе предпринято изучение деталей жирнокислотного состава на уровне ниже 1% для поиска специфичных для микроорганизмов химических веществ (маркеров) с целью их последующего использования для экспрессного анализа видового состава микробных сообществ УГТ. Такой подход применен нами ранее для определения структуры экологических микробных сообществ по химическому составу суммарной биомассы [6-9].

Возможности метода маркера в области практической медицины мало изучены. Особенно в детектировании микроорганизмов непосредственно в биологической жидкости без выделения чистых культур. Известна диагностика кандидомикоза по арабинитолу [10-12] (Демина, Larsson, Lehtonen). Неспецифическая диагностика бактерий по мурамовой кислоте в крови [13]{Lehtonen L.}. Попытки обнаружения микроорганизмов, содержащих b -оксимиристиновую кислоту [14] (Maitza,1978), диагностика видов Haemophylus по специфическим оксикислотам [15,16] (Sugimoto,1982; Brondz,1986), дифференциация видов Campylobacter [17](Dennemont,1992), контроль менингококка по наличию b -оксилауриновой кислоты в крови [18][Brandzaeg, Yantzen]. Для возбудителя гонореи Neisseria gonorrhoae ранее разработана методика ГХ-МС диагностики в режиме масс-фрагментографии (МФ). Его наличие определяется по соотношению оксикислот h12/h14>0.2 в крови или пробе из очага инфекции [19](Sud,1979).

Химические методы дифференциации микроорганизмов находят все большее примененние и оказываются нередко более быстрыми и универсальными [20,21]. Наиболее широко для этих целей используется газовая хроматография (ГХ) и газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС), которые позволяют получить уникальную информацию о составе мономерных химических компонентов микробной клетки и метаболитов [22]. Маркеры такого рода могут быть определены среди других химических составляющих суммарной биомассы биологических объектов и использованы для детектирования микроорганизмов соответствующего рода или вида при изучении микробных сообществ [23]. Различные приложения метода химического маркера приведены в обзоре S.Morgan [24]. Хемодифференциация широко используется как метод идентификации и подтверждения таксономического положения микроорганизмов. Он используется для работы с микроорганизмами, изолированными в чистых культурах и основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Примером такой системы является специализированный хроматограф Microbial Identification System, выпускаемый фирмой MIDI Inc., Делавер, США [25]. Особенности состава жирных кислот теперь используются наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии [26](Берги, 9-е изд.) и клинической бактериальной диагностике [27](Weyant,1996).

Мы проводим накопление данных по составу липидных компонентов микроорганизмов экологического, биотехнологического и клинического значения в течение пятнадцати лет. Они послужили для для целей хемодифференциации бактерий в чистых культурах [28-30][Int.J.Bact.Syst; Arch.Bact, Микробилогия- Цаплина], разработки общего подхода к определению родового и видового состава микробных ассоциаций по липидным маркерам и профилям [ 8,9] (Патент, FEMS Microb.Rev], и анализа структуры некоторых микробных сообществ: сульфатвосстанавливающих бактерий [6] [Микробиология 1994], каолина [7,9][ Микробиология , FEMS] метаногенного сообщества и активного ила [31] [Отчет по Экологии России].

Ранее нами описаны также примеры обнаружения микроорганизмов при инфекционных процессах методом ГХ-МС, в том числе для анализа вагинальной микрофлоры [32] [Вестник РАМН, 1996, № 2].

Такого рода работа не имеет аналогов в периодической научной литературе и поэтому необходимо изначально обосновать микробное происхождение каждого из используемых химических маркеров, а также отнесение этих маркеров к конкретным микроорганизмам. Мы не имеем возможности прямых параллельных сопоставлений полученных нами результатов с измерениями традиционными методами из-за сложности организации подобного эксперимента: пробу для сопоставления пришлось бы адресовать одновременно в различные лаборатории. Поэтому подтверждение факта обнаружения маркера того или иного микроорганизма мы ищем в связи с патологическим процессом в организме пациента в виде корреляции с данными обследования, анамнезом или эффектом последующей терапии.

При формировании базы данных для отнесения маркеров к конкретным микроорганизмам наряду с собственными данными использовали сведения из литературных источников для получения представлений о реальном составе сообщества микроорганизмов урогенитальной системы организма человека в норме и при патологических изменениях, а также о составе их жирных кислот.

Материалы и методы. В работе использованы данные анализа билогических жидкостей человека мужчин и женщин пациентов гениколога, уролога и сексопатолога а также здоровых доноров представленных в течение 1994-97гг на исследование из двух районных поликлиник и Центрального Научно-исследовательского кожно-венерологического института (ЦНИКВИ), г.Москва. Наличие микробных маркеров определяли в моче, вагинальном содержимом, семени и соскобах цервикального канала.

Образцы проб. Образцы биологических жидкостей обрабатывали сразу после отбора. При невозможности немедленного анализа их консервировали в органических растворителях или замораживали при -5^оС. Из 0,5-1мл пробы экстрагировали липиды в однофазной смеси растворителей вода-метанол-хлороформ в соотношении 1:2,5:1 в течение часа, после чего добавляли воду и хлороформ до образования бифазной системы. Хлороформную фазу, содержащую липиды отбирали в отдельный сосуд, упаривали досуха, а остаток высушивали и подвергали кислому метанолизу (КМ) в 0.4 мл 1М HCl в метаноле в течение одного часа при 80° С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток жидкости. В результате получали жирные кислоты в виде метиловых эфиров (МЭЖК), а альдегиды в виде диметилацеталей (ДМА). Эти компоненты двукратно экстрагировали 200мкл гексана, высушивали и обрабатывали 20 мкл N,О-бис(триметил-силил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80° С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот,спиртов и стеринов.

Аппаратура. Реакционную смесь эфиров в количестве 1-2мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы НР-5985В, НР-5973 Хьюлетт-Паккард (США), или QP-2000 фирмы Шимадзу (Япония). Для управления и обработки данных использовали штатные программы приборов. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой Ультра-1 Хьюлетт-Паккард длиной 25 м и внутренним диаметром 0.2 мм. Режим анализа 120° С - 2 мин, далее програмирование температуры 5град/мин до 300-320град. Масс-спектрометр - квадрупольный, с ионизации электронами (70эв) работал в режиме полного сканирования при определении состава основных липидных компонентов пробы (низкая чувствительность). Для выборочного детектирования целевых маркеров микроорганизмов в режиме высокой чувствительности и на превалирующем фоне биологической жидкости использовали метод селективных ионов ( масс-фрагментографии, МФ) при периодическом сканировании до восьми ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирали таким образом, чтобы селективно определять маркеры целевых микроорганизмов. В том числе использовали сильный ион m/z = 87 для детектирования малых количеств жирных кислот С10-С20, выбрав интервалы групп так, чтобы обойти интенсивные пики кислот С16 и С18, доминирующие в жирнокислотном профиле клеток макроорганизма. Для определения b -оксикислот в программу вводили общий для гомологического ряда ион 175 и специфические для каждой кислоты ионы типа М-15, а для a -оксикислот М-59. Жирные альдегиды детектировали в виде диметилацеталей по иону 75 и М-131 при несовпадении с хроматографическими пиками жирных кислот. Соответствующие специфические ионы использовали для жирных спиртов и стеринов. Дополнительными параметрами для идентификации веществ использовали относительные времена хроматографического удерживания и соотношения площадей пиков селективных ионов.

Оптимизация пробоподготовки в данном случае необходима по той причине, что искомые вещества могут быть частично в свободном виде (в виде мономеров) в результате естественного автолиза и лизиса клеток (целых и полуразрушенных ). В зависимости от их соотношения может быть выбрана более или менее сложная методика. Мы опробировали три варианта : 1) экстракция свободных липидов в смеси растворителей вода-метанол-хлороформ, 2) кислый метанолиз осажденной биомассы и 3) экстракция в указанной выше смеси растворителей с последующим кислым метанолизом сухой липидной фракции.

Обнаружено, что оптимальным является третий вариант. При этом установлено, что микробные компоненты присутствуют как в свободном виде, так как обнаруживаются в экстракте без КМ, однако основное количество находится в составе липидов и обнаруживается только после их разрушения в процессе КМ .

Выход свободных МЖК и ДМА при КМ зависит от времени метанолиза и молярности реактива. Обычно применяют жесткий режим метанолиза : 2-4N HСl в метаноле и 18 час ( в течение ночи ) при 80 - 100^оС. Однако для экспрессности анализа желательно сократить время реакции. Такой режим аргументирован необходимостью высвобождения оксикислот липида А в ЛПС клеточной мембраны грамотрицательных бактерий, связанных прочными амидными связями с моносахарами. Однако наряду с эффективной экстракцией амидсвязанных оксикислот в таких условиях происходит разрушение циклопропановых кислот, важных для идентификации энтеробактерий, псевдомонад и лактобацилл. Мы провели сопоставительные исследования эффектов метанолиза в течение 18, 3 и 1 часа и нашли, что достаточно греть пробу всего 1 час при 80^оС. При этом сохраняются интенсивные пики циклопропановых и полиненасыщенных кислот( они тоже, оказывается разрушаются при длительном метанолизе ) и в тоже время можно получить достаточную информацию об оксикислотах. Для получения корректных данных в таком случае надо лишь обеспечить получение калибровочных данных по чистым культурам банка данных в условиях проведения целевых анализов при рутинных измерениях, что мы и сделали для конкретных клинических штаммов энтеробактерий, псевдомонад и лактобацилл. Как оказалось, такое сокращение времени метанолиза приводит к двухкратной потере 3-оксимиристиновой кислоты но это не так важно, поскольку в качестве альтернативного маркера сем. Enterobacteriaceae может быть использованы цис-вакценовая, циклогептадекановая кислоты и маркеры отдельных родов этого семейства. Таким образом оптимальным вариантом пробподготовки с позиции полноты использования спектра микробных маркеров, а также включения в конечную пробу свободных и связанных липидных компонентов микроорганизмов следует проводить экстракцию в тройной смеси растворителей с выделением липидной фракции и ее последующим кислым метанолизом при 80^оС в течение 1 часа.

Состав жирных кислот и некоторых других липидных компонентов биологических жидкостей урогенитальной сферы.

В табл.1 приведен полученный нами состав проб, которые взяты у практически здоровых людей без выраженного дисбиоза или воспалительного процесса. Измерения проводили в режиме полного сканирования - записи полного масс-спектра веществ, элюируемых хроматографической колонкой. Полные хроматограммы изображены на рис.1.

Таблица 1

Состав жирных кислот биологических жидкостей урогенитального тракта (включены также альдегиды и холестерин)

* - Обозначения веществ: 17:1 - 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия - число двойных связей; h - оксикислота; а,i - в начале означает разветвление; а - в конце символов - альдегид. Например, ha17 - 3-окси-антеизогептадекановая кислота, i18а - изооктадекановый альдегид.

Основными компонентами всех исследованных жидкостей организма человека являются (более 1% ) четные кислоты с 12 - 18 атомами углерода: 18:1, 16:0, 18:2, 18:0, 16:1 (в порядке уменьшения содержания в профиле ЖК ), а также холестерин в вагинальном содержимом и семени. Иногда величину 1% превышает содержание длинноцепочечных кислот С 20 - С26 . Нечетные кислоты - 15:0 и 17:0 составляют около 1% каждая. Их содержание постоянно в липидных профилях здоровых и больных людей, что позволяет использовать в качестве инварианта (внутреннего стандарта) при относительных измерениях. Содержание разветвленных кислот, в основном С15 и С17 , составляет максимум несколько десятых процента. В сперме больше содержание полиненасыщенных кислот С20:n и С22:n, альдегидов и 2-оксикислот. Циклопропановые кислоты в моче и сперме отсутствуют ( менее 0,01 % ), а в вагинальной жидкости имеется 19cyc , обусловленная метаболитами ( палочки Додерлейна ), которые являются нормальными обитателями вагины. 3-Оксикислоты в жидкостях здоровых людей отсутствуют ( менее 0,01 % ) за исключением h16 и h18.

Таблица 2 .

Состав минорных липидных компонентов биологических жидкостей урогенитального тракта

* Обозначение веществ как в сноске к таблице 1

Как отмечалось, целью исследования является не только констатация состава жирных кислот изучаемых биологических жидкостей, но и поиска в нем специфических веществ, маркеров, микроорганизмов и доказательства их специфичности. Действительно, изучение минорных липидных компонентов (МЛК) жирнокислотной фракции жидкостей УГТ методом МФ позволило выявить компоненты, характерны для микробных липидов (Таб.2). Ряд веществ - оксикислоты h12,h14,h10,2h14, циклопропановая кислота 17cyc - не обнаруживаются у доноров, тогда как остальные присутствуют у всех групп обследованных: пациентов и доноров. Причем у пациентов их уровень содержания выше, хотя при усреднении данных по этой группе исключены данные, превышающие среднее на величину 3s. Для доказательства принадлежности этих веществ к микробиоценозу организма человека было бы идеальным показать прямыми опытами, какие жирные кислоты способны синтезировать клетки высшего организма на уровне 0,01-1% от суммы клеточных ЖК. Тогда остальные наблюдаемые в биологической жидкости вещества можно считать экзогенными, в том числе микробного происхождения. Однако подобное исследование представляется весьма проблематичным in vivo, так как должны предполагать в конечном счете эксперименты с людьми, а любые эксперименты in vitro будут не более доказательными, чем те косвенные доводы, которые мы собираемся привести в обсуждении.

Нами проведен анализ состава МЛК биологических жидкостей УГТ более чем трехсот пациентов уролога и гинеколога. Изменение содержания анализируемых веществ в этих пробах приведено на рис.2-4. На точечных диаграммах рисунков данные приведены в относительном выражении. Они нормированы на величину пика маргариновой (гептадекановой) кислоты, которая, по нашим многочисленным наблюдениям, имеет постоянную концентрацию в биологических жидкостях человека и животных. Ее содержание составляет 0,6мкг/мл в крови и жидкостях, содержащих в заметном количестве липиды или клеточные компоненты - в вагинальном содержимом, семени, гное, мокроте и т.п. На диаграммах количество маргариновой кислоты соответствует 100 единицам. Оказалось, что все минорные компоненты обязательно встречаются у тех или иных пациентов, а их содержание меняется в разных пределах. В таблице 3 приведены абсолютные диапазоны изменения их концентраций, а также важные точки множеств (кластеров) выявленные при статистической обработке данных. Статистический анализ, проведенный по пакету программ Statistica показал разделение множества значений концентраций большинства МЛК на два кластера.

Таблица 3.

Пределы концентраций микробных маркеров в биологических жидкостях урогенитальных органов и максимумы кластеров.

(относительно маргариновой кислоты, принятой за 100)

* Обозначение веществ как в сноске к таблице 1

** Один кластер при нулевом значении в случаях патогенных или условно-патогенных микроорганизмов

*** Второй кластер не выявлен

Традиционно известно, что клетки высших организмов синтезируют лишь прямоцепочечные, четные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты [33] [А.Уайт и др. “Основы биохимии” в 3-х томах, 1981 ]. Исходя из этого можно полагать, что источником нечетных, разветвленных, циклопропановых и b -оксикислот, обнаруживаемых в биологических жидкостях человека и животных следует относить к микрофлоре, колонизирующей высший организм. Экспериментальным подтверждением тому является исследование ЖК-состава фосфолипидов эритроцитов [34] [Alexander,1985], в котором фосфолипиды были предварительно препаративно выделены, а затем исследован их жирнокислотный состав. Оказалось, что чистые фракции фосфолипидов эритроцитов содержат только прямоцепочечные четные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты вплоть до уровня 0,01%. Этот вывод можно распространить и на другие форменные элементы крови, поскольку они происходят из одного источника синтеза - стволовых клеток. Действительно, показано, что в составе липидов клеточных стенок эритроцитов, тромбоцитов и их цитоплазмы содержатся только прямоцепочечные четные насыщенные и ненасыщенные ЖК с числом атомов от 14 до 24. Это особенно важно для лейкоцитов, поскольку они составляют значительную долю гнойного отделяемого при воспалительном процессе. Это значит, что обнаружение прочих жирных кислот в биологической жидкости следует относить за счет колонизирующей микроорганизмов. Следует отметить, что липидные компоненты микробного происхождения не обязательно принадлежат жизнеспособным или целым клеткам. В организме происходит постоянное уничтожение посторонних, не состоящих в симбиозе с хозяином, организмов фагоцитирующими клетками. Поэтому при ГХ-МС исследовании мы получаем инфрмацию не только от живых клеток, но и от частично или полностью переваренного фагами и ферментами материала. Последнее обстоятельство важно для сопоставления с традиционными методами бактериологии, предполагающими выделение и подращивание жизнеспособных микроорганизмов.

Практика наших исследований БЖ урогенитального тракта дает еще одно доказательство экзогеннного происхождения определенных групп ЖК в их составе. Анализ вариаций жирнокислотного состава у практически здоровых людей и пациентов с проблемами деторождения или заболеваниями, передаваемыми половым путем (т.е. без выраженного воспалительного процесса) показывает, что концентрация четных ЖК, присущих организму-хозяину, колеблется в пределах % от средней величины, а концентрация разветвленных ЖК меняется от некоторого максимума до нуля (предела детектирования) - рис.5. Как видно из рисунка вариации состава ЖК позволяют рассортировать их на свои и чужие. В частности, насыщенные нечетные пента-, гепта- и нонадекановую кислоты следует отнести к собственным кислотам макроорганизма: их разброс того же порядка, что и у четных.

Оксикислоты и циклопропановые кислоты представляют особую группу веществ, бактериальное происхождение которой не вызывает сомнений. Тем не менее, отметим, что действительно, они встречаются далеко не у всех пациентов, кроме метиленоктадекановой кислоты (С19cyc), или лактобацилловой, у женщин, поскольку она является составляющей клеточных липидов лактобацилл вагины.

Наконец, следует отметить, что прямоцепочечные a -оксикислоты (с числом атомов углерода 16 и более) и жирные альдегиды также относятся к клеткам хозяина. Известно, что они входят в состав соответственно сфинголипидов и плазмологена, характерных для некоторых специфических клеток млекопитающих, в том числе - сперматозоидов [4][ Lenzi A. Их концентрация в сперме и вагинальной жидкости достаточно высока, чтобы препятствовать использованию этих веществ для диагностики некоторых микроорганизмов также имеющих a -оксикислоты и альдегиды в составе клетки.

В пользу экзогеного происхождении МЛК свидетельствует разделение множества значений их концентраций у разных пациентов на два кластера (табл.3). Первый из них, более узкий, имеющий нормальное распределение, близок к уровню содержания соответствующих МЛК у доноров, то-есть, повидимому соответствует норме. Второй кластер с широким, несимметричным распределением содержит множество значений, превышающих уровень содержания МЛК у доноров (Рис.6.) Его следует связать с патологическими отклонениями. Действительно, сопоставление данных анализа МЛК с клинической картиной заболевания подтверждает это предположение. Например, для пациентов с диагнозом гоноррея характерно наличие 3-гидроксидодекановой кислоты (h12). При вагинитах или других воспалительных процессах наблюдается появление или увеличение по сравнению с нормой ряда веществ, которые могу быть связаны с инфекцией. Например, стафилококков (антеизо-кислоты) или псевдомонад (гидроксидекановая, 2-гидроксилауриновая) при аэробной форме, Peptostreptococcus anaerobius (изомиристиновая кислота, i14) или Bacteroides (гидрокси-изо-кислоты). Замечено, что увеличение концентрации 10-метилоктадекановой (туберкулостеариновой) кислоты характерно для больных туберкулезом, а увеличение 3-гидроксиоктадекановой кислоты, специфичной для Helicobacter pylori, в моче в большинстве случаев наблюдается у пациентов с гастритом или язвой желудка. Появление 3-гидроксиизоэйкозановой, 3-гидроксиэйкозановой, 3-гидроксидокозановой кислот, содержащихся в клетках Chlamidia trachomatis, характерно для пациентов с хламидиозом.

Оценка уровня концентраций маркеров микроорганизмов в сообщестах УГТ, соответствующих норме, должна быть произведена в результате обследования здоровых доноров. Однако при решении этой задачи мы столкнулись с тремя трудностями, которые оказались для нас непреодолимыми. Во первых, найти группу людей с нормальной микрофлорой, во вторых, найти организацию, которая могла бы подтвердить содержание широкого круга микроорганизмов, определяемых по липидным маркерам методом ГХ-МС. В третьих, оказалось, что у практически здоровых людей наблюдаются отклонения в концентрации некоторых маркеров, без патологии в анамнезе. На наш взгляд мы нашли способ выявить норму на основании статистической обработки данных обследования пациентов уролога и гинеколога. Эти пациенты имели жалобы по поводу воспалительных процессов в урогенитальных органах, бесплодия или заболеваний, передаваемых половым путем (ЗПП). Мы обнаружили, что в каждом отдельном случае выявляется один или несколько микроорганизмов из тридцати постоянно контролируемых, которые превалируют в микробном пейзаже. Это привело к предположению, что именно эти организмы развиваются сверх нормы, и пациент “болен” по этим микробам, а по остальным “здоров”. Естесственно, это не относится к строгим патогенам, передаваемым половым путем: гонококку, хламидиям, трепонеме, для которых нормой является их отсутсвие. Можно считать нормой отсутствие большинства грамотрицательных микроорганизмов, так как их маркеры, оксикислоты, у многих пациентов не обнаруживаются (т.е. находятся за пределами чувствительности метода). Маркеры всех прочих микроорганизмов, являющихся симбионтами организма человека и условными патогенами, должны иметь соответственно двоякий статус: симбионта или патогена. Вероятно, переход в патогенное состояние связан с увеличением концентрации клеток микроорганизма в локусе и сдвиг распределения концентраций с образованием отдельного кластера. Распределение концентраций двадцати восьми маркерных веществ микроорганизмов в трех биологических жидкостях показано на рис.3-5. Визуально можно определить зону скопления точек вблизи нижних значений концентраций, которая повидимому соответствует норме. Статистическая обработка данных по программе Statistica показала, что действительно, вся совокупнось концентраций маркеров микроорганизмов более или менее явно разделилась на два кластера. Некоторые из них приведены на рис.7... abcd. При этом максимум первого кластера (норма) для маркеров ЗПП и оксикислот (кроме h16 и h18) приходится на ноль. Симбионты макроорганизма имеют отличную от нуля концентрацию в норме, поэтому их кластер находится выше нулевой линии. На основании этих данных верхняя граница первого кластера (расстояние +s ) принята в качестве нормы, а все состояния за пределами этой границы воспринимаются как повышение активности микрофлоры, способное привести к воспалительному процессу или другим патологическим проявлениям.

Приведенные соображения свидетельствуют в пользу микробного происхождения обсуждаемых минорных жирных кислот биологических жидкостей УГТ.

3. Диагностическая значимость минорных компонентов биологических жидкостей УГТ. Литературно-аналитическое обоснование базы данных для описания урогенитального сообщества микроорганизмов по химическим маркерам.

Для определения диагностической значимости минорных компонентов биологических жидкостей УГТ, приписываемых нами к микробным, необходимо сопоставить полученные данные по конкретным веществам с известными данными о составе микроорганизмов соответствующих органов и составом самих микроорганизмов.

Обобщенные сведения по вагинальному микробиоценозу можно найти в фундаментальном руководстве для клиницистов [35] [Clinical Мicrobiology Mannual. p.....]

В вагинальном микробном сообществе различают нормальную и условно-патогенную микрофлору, а также возбудителей венерических и других заболеваний, передаваемых половым путем. К нормальной микрофлоре относят лактобациллы, бифидобактерии, коринебактерии и эпидермальный стафиллококк [36] (Hamman,1982). Количественный бактериологический анализ вагинального сообщества здоровых женщин показал, что в 1г вагинальной жидкости содержится 10⁸ клеток аэробных и 10⁹ клеток анаэробных бактерий [37](Bartlett,1977). В основном это Lactobacillus, Peptococcus, bacteroides, Staphilococcus epidermidis, Corinebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Eubacterium. В предменструальный период существенно уменьшается число аэробов. В зависимости от степени чистоты влагалища в микрофлоре могут присутствовать гнилостные бактерии родов Bacillus, Proteus, Clostridium, Spirochaeta. Их разделяют с гноеродными бактериями, представляющими как локализованную , так и генерализованную инфекцию. Ее наиболее частые возбудители - патогенные стафиллококки, стрептококки, Pseudomonas aeruguinosa, Proteus, E.coli, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Flavobacterium meningosepticum, Neisseria meningitidis [38](БМЭ,1984). Кроме того, возможно наличие микроскопических грибов [39](Hamman,1982), а также Peptostreptococcus, ассоциированных с Bacteroides и Trichomonas [40](Brockman,1979). У пациентов венерологических клиник превалирует Candida, Chlamidia, Trichomonas, Mycoplasma, которые обычно сопутствуют N.gonorrhoae. У молодых чаще встречается С.trachomatis, у старших женщин - T.vaginalis [41](Person,1979). У девочек в основном обнаруживается Corinebacterium vaginale, дрожжи, Mycoplasma, Staphylococcus и дифтероиды. Находят также N.gonorrhoae, Trichomonas, Chlamidia, Lactobacillus у старших, а энтеробактерии - у младших девочек [42](Hammarschlag,1978).

Микобактерии туберкулеза не часто выявляют в патологии урогенитальных органов, хотя проблема женского генитального туберкулеза явно существует, судя по литературным данным [43,44][Kabra,1994; Колачевская,1994]. Обсуждаются вопросы диагностики [45][Голышевская, 1995], передачи инфекции половым путем [46](Cooper,1970] и связанного с заболеванием бесплодия [47][De Luca, 1982]. Отсутствие рутинного контроля микобактерий видимо связано с трудностью и длительностью их культивирования.

Поддержание относительно стабильного качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища имеет защитное значение , т.к. он является защитным барьером для проникновения патогенных бактерий в выше лежащие отделы половых путей при определенных нормальных условиях существования организма. По данным [48]Wilks M, et al 1984 независимо от возраста у здоровой женщины количество анаэробов преобладает над аэробами в 10 раз в микробиоценозе вагины. По Bartlett [37], концентрация анаэробных микроорганизмов составляет 10*9кл/г, аэробов 10*8кл/г. Ранговое расположение доминирующей микрофлоры, исходя из концентраций более 10*5 КОЕ/г, имеет следующий порядок :

Наиболее полно состав вагинального микробного сообщества описан в недавно вышедшей монографии, посвященной изучению этиологии и патогенеза анаэробной инфекции у акушерских и гинекологических больных [49](Цвелев,1995).

Значительно меньше исследований посвящено микрофлоре семенной жидкости. Из семени быка выделены Pseudomonas aeruguinosa, E.coli, Staphilococcus и Vibrio foetus [50](Kozlowska,1977), а также Corinebacterium, Micrococcus, Staphilococcus, Proteus, Alcaligenes. В изязвлениях мужских половых органов найдены аэробные и анаэробные бактерии, Mycoplasma, Нaemophylus ducrey, Treponema pallidum, Herpes simplex virus, дрожжи и нитчатые грибы.

Свойства микоплазм из урогенитального тракта человека недавно описаны в обзоре [51](Раковская,1992). В нем обитают три вида микоплазм: Mycoplasma hominis, M.urealyticum, M.genitalium. Уреаплазмы обладают протеолитической и фосфолипазной активностью в результате чего могут приводить к самопроизвольному аборту и гибели плода за счет высвобождения арахидоновой кислоты и увеличения концентрации простагландинов. Кроме того, они обладают эндо- и экзонуклеазами и могут воздействовать на генетическую информацию клеток. Микоплазмы относятся к условно-патогенным микроорганизмам. Кроме всего сказанного они обладают иммуномодулирующим действием. Выявляются при простатоуретрите, из бесплодного семени. Вызывают отклонения в спермограмме. Часто выделяются при женском бесплодии [52](Акунц,1989). Недавно обнаружены новые микроорганизмы, выделяемые при вагинитах. Это Mobiluncus mulieris и M.curtissii - грамвариабельные изогнутые палочки [53,54](Hofstad,1990; Holst,1990).

Из работ, посвященных изучению клеточных компонентов микроорганизмов этой ниши, следует что многие из них имеют четкие маркеры. Остановимся сначала на этой группе бактерий.

Lactobacillus. Нормальная микрофлора вагины предполагает наличие лактобацилл - палочек Дедерлейна. Лактобациллы имеют четкий маркер - лактобацилловую кислоту [55], которая встречается и у других бактерий. Если отбросить сугубо экологические микроорганизмы (не свойственные организму человека), то в сообществе вагины можно обнаружить две группы микроорганизмов, обладающих этим же признаком. Это псевдомонады и некоторые энтеробактерии. Однако, они редко обнаруживаются здесь в заметных концентрациях и могут быть учтены, как будет видно позднее, в уравнении баланса концентраций жирных кислот.

Chlamydia trachomatis. Этот внутриклеточный паразит имеет сразу три маркерных оксикислоты: 3-оксиэйкозановую (3h20), 3-окси-изоэйкозановую (3hi20) и 3-оксидокозановую кислоту (3h22) [56,57](Nurminen,1985; Bidavid,1989), которые удобны для масс-спектрометрического детектирования..

Mycobacterium tuberculosis. Неспецифическим тестом на микобактерии, выполняемом методом ГХ или ГХ-МС, является детектирование туберкулостеариновой кислоты в очаге поражения [58] (Clinical Microbiology, p.....-]. Дополнительные данные, полученные недавно по 3-оксикислотам липидов микобактерий позволяют его сделать специфичным для M.tuberculosis и других представителей рода [59] [Allugupalli,1994]. Маркером M.tuberculosis при этом оказалась 3-ОН-2,4,6-триметил-тетракозановая кислота. Накопленный к настоящему времени материал по составу липидов микобактерий [60-62] [Asselineau, Liquin, Jantzen] дает принципиальную возможность разработки метода их быстрого определения непосредственно в биологических жидкостях, используя селективность и чувствительность метода ГХ-МС.

Eubacterium. Эти бактерии регулярно обнаруживают в урогенитальных изолятах. Их маркер, дегидрохолестерол (копростанол) присутствует в вагинальной жидкости [32](Вестник РАМН). Известно также, что копростанол является продуктом интерактивного метаболизма Eubacterium и клеток организма-хозяина [63][Mott,1979]. Он легко определяется хроматографически и используется в качестве маркера фекальных загрязнений окружающей cреды [64][Nichols,.....].

Corinebacterium urealyticum. Этот нормальный обитатель вагины имеет специфические маркерные вещества - миколовые кислоты. Они обладают уникальным строением - наличием оксигруппы (ОН) в положении 3 и алифатического радикала С10-С16 в положении 2 молекулы [65][Gailly,1982]. Для С.urealyticum известны кослоты вида 28:2, 28:1, 30:3, 30:2, 32:3, 32:2, причем таксономически значимыми являются 30:3 и 28:1 [66][Herrera-Alcaras,1993 ].

Klebsiella. K.pneumoniae имеет отличительный признак 2-оксимиристиновую кислоту в составе ЛПС, которая в данном сообществе оказывается маркером рода (собственные измерения)

Peptostreptococcus anaerobius. Показано, что этот микроорганизм имеет в профиле ЖК редко встречающиеся четные изокислоты с числом атомов углерода от десяти до шестнадцати [67,68][Moss,1977, Lambert,1979]. Максимальной в профиле является изотетрадекановая кислота i14, которую можно использовать в качестве маркера.

Bacillus. Бациллы составляют часть микрофлоры, связанной с чистотой УГТ и не участвуют в патологических процессах. Их присутствие можно детектировать по специфическим разветвленным кислотам с 13 атомами углерода: i13 и а13. B.cereus и B.subtilis имеют также редко встречающуюся изопальмитиновую кислоту i16. Она может быть специфичной для бацилл в данном сообществе при учете пептострептококка и стрептомицетов по их собственным маркерам.

Pseudomonas. Псевдомонады имеют четкие маркеры из состава С10 и С12 оксикислот, которые допускают их ограниченную видовую дифференциацию даже на фоне биологической жидкости. В качестве родового признака удобно использовать 3-оксидекановую кислоту. Альтернативных микроорганизмов с таким признаком в биологических жидкостях человека нет. Для P.aeruginosa возможна видовая идентификация по специфичной для вида 2-оксидодекановой кислоте [69]. В наших клинических штаммах P.aeruginosa обнаруживается еще один маркер 3h12:1. Кроме того у некоторых из них отсутствует 3h12 по сравнению с известным из литературы соотношением 3h/2h изомеров равном 2/3 [69].

Clostridium perfringens. Имеет четкие маркеры, характерные для группы клостридий, включающей, кроме C.perfringens, также С.histolyticum и C.oedematiens. Это 10-оксистеариновая и 10-оксиоктадеценовая кислоты, легко определяемые по специфическим ионам в масс-спектре [70][ Патент наш]. Эти вещества не являются клеточными компонентами самих клостридий, а связаны с разложением клеток ткани макроорганизма бактериальными ферментами [71][Koichi,1984]. Ранее клостридии в УГТ не контролировали. С.perfringens, так же как и Eubacterium входит в состав основной микрофлоры кишечника. Поэтому ранее мы обнаруживали их маркеры (10-оксикислоты) во всех биологических жидкостях человека, а также в сточных водах и объектах окружающей среды наряду с копростанолом [31].

Сlostridium sp. В исследуемых пробах обнаруживается тетрадеценовая кислота, которую по нашему банку данных следует отнести к группе клостридий, включающей С.fallax [ 72] [ статья, где много клостридий]. В некоторых случаях этот маркер может относится также к Streptococcus pneumonia.

Bacteroides fragilis. Анаэробные бактерии группы B.fragilis имеют хороший маркер - пару разветвленных оксикислот: изогептадекановую (основную) и антеизогептадекановую - в несколько раз меньшую по концентрации [73,74] [ Mayberry,1982; Brondz,1991].

Streptococcus. Большинство стрептококков “невидимы” на фоне компонентов биологической жидкости из-за совпадения собственных жирных кислот с кислотами субстрата. Исключение составляет группа оральных стрептококков S.mutans, S.salivarius и др., имеющих в составе декановую кислоту С10 [75] [ Tsuchiya,1986]. Энтерококки группы S.faecalis, S.faecium также могут быть обнаружены при их лидерстве в сообществе по лактобацилловой (19cyc) кислоте [76][Седов,1983], так как сами лактобациллы обнаруживаются в малых количествах и присущи лишь вагинальной микрофлоре. Псевдомонады, также имеющие 19cyc в профиле, могут быть учтены аналитически по другим маркерам.

Candida albicans. Специфическим признаком этих микроскопических грибов в липидной фракции биологических жидкостей человека является гептадеценовая кислота [10][Демина,199..].

Микроскопические грибы. Неспецифическим маркером клинически значимых микроскопических грибов (Aspergillus, Candida, Mucor и др.) является эргостерол [77][Larsson...].

Flavobacterium. Представители этого рода известны в патологии воспалительных процессов половых органов женщин [78], а также в инфекционной патологии новорожденных [79](Белокрысенко). В последнем случае инфекция передается плоду от матери. Поэтому мы сочли необходимым их контролировать. Флавобактерии имеют достаточно маркеров для детектирования в биологических жидкостях. Это изогептадеценовая кислота i17:1, наиболее удобная в качестве аналитического признака. Кроме того они имеют разветвленные нечетные 2-оксикислоты в составе клеточных сфинголипидов (2hi15, 2hi17), которые так же могут служить маркерами в клинических пробах [80][Dees,1986].

Streptomyces. В профилях жирных кислот биологических жидкостей пациентов присутствует значительное количество изогексадекановой кислоты i16, существенно превышающее возможную долю P.anaerobius и Bacillus, имеющих это вещество в составе клеточной мембраны. Единственными организмами (из известных нам), обладающих этим признаком являются представители рода Streptomyces. Штаммы стрептомицетов, имеющие до 40% i16 в профиле жирных кислот обнаружены нами ранее в клинических изолятах из ануса [10][Демина....]. В литературе имеются упоминания об участии стрептомицетов в воспалительных процессах в организме человека [81][Werder,1973].

Helicobacter. Практически везде в профиле минорных компонентов жидкостей УГТ присутствует оксиоктадекановая кислота h18. Известны два вида микроорганизмов, для которых характерна эта оксикислота: Francisella tularensis [82] и Helicobacter (Campylobacter) pylori [83][Geis,1990]. Francisella является возбудителем туляремии и ее присутствие у обследуемых нами пациентов маловероятно. Поэтому наличие h18 следует отнести к Helicobacter pylori или к неизвестному пока источнику. H.pylori традиционно связывают с язвой желудка и нет сведений о колонизации им организма человека вне связи с этим заболеванием. На наш взгляд это обусловлено трудностями диагностики этого организма.

Оставшаяся часть членов сообщества УГТ повидимому не имеет специфических веществ. Тем не менее, если два или несколько микроорганизмов дают совместный вклад в хроматографические пики какх-либо веществ, то они могут быть разделены с использованием независимых уравнений баланса, по методике, разработанной нами для экологических сообществ микроорганизмов [ 6-9,32 ].

Neisseria gonorrhoaea. Гонококк довольно часто обнаруживается у пациентов уролога и гинеколога. Этот вид характеризуется высоким содержанием 3-оксилауриновой кислоты, которое составляет 10-20% суммарного профиля ЖК. Несколько меньше содержание 3-оксимиристиновой кислоты [19,84] [Sud,1979; Jantzen,.1978]. Эти кислоты являются частью липида А в ЛПС нейссерий, а также псевдомонад и ацинетобактера, являющихся возможными членами микробного сообщества УГТ. Их перекрывание может быть учтено в простой формуле, поскольку альтернативные организмы имеют маркеры. Кроме того, они обычно отсутствуют в пробах (нет 2h12) и вся величина 3h12 приходится на долю гонококка. В работе I.J.Sud предложено эмпирическое правило, по которому положительный диагноз по гонококку следует выносить, если соотношение 3h12/3h14>0,2. Однако оно не пригодно при наличии часто сопутствующих гонококку бактерий семейства Enterobacteriaceae и Haemophylus. Кроме того, как показывает статистическая обработка данных (n=150) содержание 3h12 не коррелирует (k<0,5) c 2h12 и3h14, что означает, что при данных условиях анализа и профиле жирных кислот реальных клинических штаммов гонококка и конкурирующих микроорганизмов 3-оксидодекановая кислота является его специфическим маркером.

Bacteroides urealyticum. Этот микроорганизм является единственным, который может быть ассоциированным с 3-оксигексадекановой кислотой в биологических жидкостях человека. Его содержание составляет 12% в составе клеточных ЖК [74][Brondz,1991]. Конечно, есть другие бактерии: Brucella, Francisella, Pseudomonas putida, cодержащие 3h16, однако первые два организма являются строгими патогенами эпидемиологического значения, а P.putida специфичен для экологических микробных сообществ. Их участие в сообществах УГТ в общем случае маловероятно. Бактероиды и Helicobacter также имеют эту кислоту, но их доля может быть учтена в расчетной формуле на основании величин их собственных маркеров и их соотношения с 3h16.

Fusobacterium, Haemophylus. Единственным отличительным компонентом в клеточных ЖК эти бактерий является 3-оксимиристиновая кислота (3h14) [85,86]], которая к тому же встречается и у других грамотрицательных организмов клинического значения, таких как E.coli, Klebsiella, Serratia и другие. Поэтому Fusobacterium, Haemophylus могут быть заметны лишь по остатку в уравнении баланса для 3h14.

Staphylococcus. Известно, что стафилококки содержат нечетные изо- и антеизо-разветвленные кислоты с числом атомов углерода 15,17 и 19 [ 87,88]. Три клинически важных вида этого рода бактерий (S.aureus, S.haemolyticus, S.epidermidis) могут быть приближенно разделены при использовании разницы в соотношении этих кислот в профиле ЖК.

Группа Corinebacterium (дифтероиды)-Listeria. После учета всех микроорганизмов, имеющих в составе ЖК антеизо-гептадекановую кислоту, часто наблюдается остаток. Представляется наиболее вероятным отнести его за счет неучтенных коринебактерий, известных особенно высоким содержанием кислот а15 и а17, и по этому признаку выделенных в отдельную группу СDC A-3,A-4, A-5, B-1a, B-3a, B-1b, B3b, Corinebacterium aquaticum (а также листерий и бревибактерий) [Bernard,1991]. Известно, что в вагинальном содержимом и семени содержаться коринеформные бактерии, отличные от C.urealyticum [P.Riegel, ...,J.M.Scheftel-искать по MedLine]

Trichomonas vaginalis. Профиль жирных кислот Trichomonas vaginalis и T.foetus не имеют признаков отличающихся от компонентов биологической жидкости, так как трихомонады не синтезируют ЖК de novo, а утилизируют их из компонентов клеток субстрата (Beach,1990). Известно также об участии этого простейшего в метаболизме холестерина хозяина [ ].

Treponema pallidum. Возбудитель сифилиса, как оказалось, так же не имеет своего аппарата синтеза жирных кислот и выстраивает свои липиды из ЖК клеток организма-хозяина (Matthews,1979).

Микоплазмы не имеют клеточной стенки, но зато имеют трехслойную мембрану. Мембрана на 41% состоит из липидов, из которых 60% нейтральные жиры: холестерин, его эфиры, триглицериды и свободные ЖК.

Gardnerellа. Все компоненты жирные кислоты Gardnerella(Haemophylus) vaginalis имеют аналоги в фоновой биологической жидкости, и поэтому этот организм не может быть индицирован по известным на сегодня липидным веществам.

3.3. База данных для качественного и количественного определения микроорганизмов на фоне липидов биологической жидкости. Разработка алгоритма расчета.

Мы проводим накопление данных по составу липидных компонентов микроорганизмов экологического, биотехнологического и клинического значения в течение пятнадцати лет. Они послужили для для целей хемодифференциации бактерий в чистых культурах [ Int.J.Bact.Syst; Arch.Bact, Микробилогия- Цаплина], разработки общего подхода к определению родового и видового состава микробных ассоциаций по липидным маркерам и профилям [ Патент, FEMS Microb.Rev], использованию этого принципа в клинических исследованиях [Вестник РАМН, 1996, № 2] и анализа структуры некоторых микробных сообществ: сульфатвосстанавливающих бактерий [Микробиология 1994], каолина [ Микробиология , FEMS] метаногенного сообщества и активного ила [Отчет по Экологии России]. С учетом этого опыта, а также описания МЛК микроорганизмов УГТ в предыдущем разделе, в таблице 4 приведен список специфических веществ микробного происхождения и их их отнесение к конкретным родам и видам.

Таблица 4.

Список химических веществ банка данных с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются.

Вещества приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соотвествует хроматографическому времени удерживания.

* -* - Обозначения веществ: 17:1 - 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия - число двойных связей; h - оксикислота; а,i - в начале означает разветвление; аlc - в конце символов - спирт, cyc - циклопропановая кислота. Например, ha17 - 3-окси-антеизогептадекановая кислота, 2h24alc - 2-окситетракозиловый спирт.

**- имеется в виду 3-оксикислоты, если не указано положение гидроксила

3.4. Результаты систематических анализов состава микробных маркеров в урогенитальных жидкостях.

На рис. а,б приведены масс-фрагментограммы первой группы ионов используемой нами программы исследования. В этой группе наряду с общим для ряда ЖК ионом 87 детектируются ионы 175 и 287, характерные для 3-оксидодекановой (3h12) кислоты, маркера гонококка. После курса антибиотикотерапии в отношении гонококка эти пики на масс-фрагментограммах липидного экстракта спермы больного С. не наблюдаются (рис...б). Из собственных жирных кислот семени на хроматограмме по иону 87, специфичному для гомологического ряда жирных кислот, можно наблюдать лауриновую, миристиновую и гексадеценовую кислоты. Как видно, характерные для микроорганизмов ЖК i13, a13, i14, i15, a15, i16 и оксикислоты 3h10 (Pseudomonas, общий маркер) и 3h12 (маркер P.aeruginosa) хорошо разделяются хроматографически и представляют собой пики аналитического значения, то есть - пригодные для селективного детектирования и мониторинга.

Аналогичная картина получена при анализе семени, мочи и вагинального содержимого при обследовании супругов Н.Ф.З. с проблемой одиннадцатилетнего периода бездетного брака. Жена неоднократно обследовалась по поводу воспалительных урогенитальных процессов без четкой идентификации возбудителя. Гонококк в мазках цервикального канала и устья уретры ни разу не обнаруживали при умеренном лейкоцитозе. Неоднократно получала курсы разных антибиотиков длительностью 5-10 дней. При обращении к нам у мужа в провокационном тесте микроскопически диагностирована гоноррея. При ГХ-МС исследовании гонококк идентифицирован у обоих супругов. Два курса лечения антибиотиками (бициллин, сульфонамиды, диоксициклин, сумамед) оказались безуспешными: маркер гонококка обнаруживали масс-спектрометрически. Результат наконец был получен после 20-дневного курса эритромицина. Очередной анализ дал отрицательный результат, женщина забеременела.

Серия анализов проведена при обследовании пациентки О. в сязи с обнаружением повышенного содержания туберкулостеариновой кислоты (ТСК) в вагинальном содержимом и моче. ТСК является известным маркером микобактерий, нокардий и некоторых коринебактерий. В данном случае он может быть отнесен лишь к микобактериям туберкулеза, так как в исследуемых пробах отсутствуют другие специфические признаки нокардий, коринебактерий и иных микобактерий. Для уточнения очага локализации возбудителя в организме проведен анализ мокроты и крови тем же методом детектирования микробных маркеров в липидной фракции. Результаты обследования (рис. abcd) показывают, что наибольшая концентрация ТСК (по отношению к реперу биологической жидкости - нонадекановой кислоте) наблюдается в вагинальном содержимом, далее по убыванию в моче, крови и в мокроте. Это означает, что возбудитель локализуется в вагине, в меньшей степени колонизирует мочевой канал а продукты деструкции микобактерий фагами на слизистых попадают в кровь. Легкие при этом сободны от возбудителя. Проведенный курс антибиотикотерапии в отношении микобактерий туберкулеза привел к снижению уровня содержания маркера микобактерий до нормального.

Судя по литературным данным мы впервые провели систематические наблюдения за содержанием 10-оксистеариновой кислоты (10h18), маркера Clostridium perfringens, в жидкостях УГТ. Оказалось, что в моче и семени его концентрация редко выходит за пределы среднестатистической нормы. В вагинальном содержимом, напротив, обращают внимание случаи превалирующего расчетного значения концентрации клеток C.perfringens. Причем отмечается “подмена” C.albicans на C.perfringens при клинических признаках молочницы и многолетней неудачи противогрибковой терапии. Хроматографический пик 10h18 регистрируется в четвертой группе программы МФ по иону 273 (рис. ) вместе с оксикислотами 3h16 и 3h18, по которым детектирутся B.urealyticum и Helicobacter pylory соответственно. Там же контролируется C.trachomatis по трем оксикислотам, характерным только для этого микроорганизма: 3-оксиизоэйкозановой (hi20), 3-оксиэйкозановой (h20) и 3-оксидокозановой (h22). Для детектирования этих маркеров используется общий для 3-оксикислот ион 175, подтверждающие ионы М-15 (399 и 427) (в метил-триметилсилильных производных) и характерные времена удерживания.

Результаты анализа представляют в виде таблицы (рис ), в которой указывают вид микроорганизма, его относительную концентрацию в компьютерных единицах, пропорциональных числу клеток, отнесенных к концентрации инварианта биологической жидкости - гептадекановой кислоты. Для удобства выявления превалирующих микроорганизмов микробный профиль изображают в виде гистограммы. Результат сопоставляют с уровнем верхнего интервала среднестатистической нормы.

Заключение.

Проведенное исследование состава ЖК биологических жидкостей пациентов гинеколога и уролога показало, что все они содержат минорные количества (менее 1% от суммы жирных кислот) липидных компонентов – оксикислот, разветвленных и циклопропановых кислот и стеринов. Ряд из них имеет бесспорно микробное происхождение. Статистическая обработка данных позволила выявить два множества (кластера) значений концентраций минорных ЖК. Один из них с меньшим значением средних величин можно отнести к норме, а другой – с высоким средним уровнем – к патологии, т.е. воспалению. В плане диагностической значимости мы бы хотели, чтобы эта работа рассматривалась как постановочная, как наблюдение широкого плана за минорными компонентами биологических жидкостей УГТ, которые с большой долей вероятности могут быть приписаны условно и безусловно патогенным микроорганизмам. Они могут быть использованы для целей контроля инфекции, дисбиоза и воспалительных процессов этой сферы организма человека и контроля за ЗППП.

В дальнейшем можно планировать и выполнять эксперименты для основательного подтверждения связи каждого из перечисленных здесь веществ с конкретными микроорганизмами, в том числе с экспериментальным инфицированием животных, как мы это делали ранее [32,70], и наблюдением в клинике определенной инфекции. То есть провести по каждому маркеру индивидуальное исследование со строгим доказательством его причастности к конкретному микроорганизму. Здесь же мы хотели в целом показать возможную масштабность подхода к бактериальной диагностике в организме человека по химическим маркерам микроорганизмов и перспективу его использования в качестве универсального альтернативного метода экспрессного контроля инфекции и воспалительных процессов.

Литература

1. Pitt. Gas chromatographic-mass spectrometric characterization of unsaturated fatty acids in urine. J.Chromatogr, 1990, Dec.
2. Ahluwalia. Fatty acid composition of lipids ofbull, boar, rabbit and human semen. J.Reprod.Fertil. 1969, Apr 18(3)
3. Lenzi A et al, Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Hum.Reprod.Update, 1996, May-June 2(3) : 246-56.
4. Nissen......... Composition of lipid-bound fatty acids of human semen in relation to its fertility values, Andrologia, 13, (1981)
5. Осипов Г.А., Назина Т.Н., Иванова А.И. Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато-масс-спектрометрии.// Микробиология.-1994.-Т.63.-Вып.5.-С.876-882.
6. Турова Е.С., Осипов Г.А. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине. Микробиология, 1996, 65(5), 682-689.
7. Осипов Г.А. // Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов. //Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Приоритет от 24 дек.1993г.
8. Osipov G.A., Turova E.S. (1997) Studying species composition of microbial communities with the use of gas chromatography-mass spectrometry. Microbial community of kaolin. FEMS Microbiol.Rev. 20 (1997) 437-446.
9. Поздоровкина В.В, Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л., Демина А.М. Газохроматографическая диагностика кандидоза и мониторинг эффективности противогрибковой терапии по уровню арабинитола и маннозы у детей. Антибиотики и химиотерапия, №5, 1998.
10. Christenson B., Wiebe T., Pehrson C., Larsson L. Diagnosis of invasive candidiasis in neutropenic children with cancer by determination of D-arabinitol/L-arabinitol ratios in urine. J.Clin.Microbiol. 35(3), 636-640, 1997.
11. Lehtonen L. Candida
12. Lehtonen L., Eerola E., Oksman P. Muramic acid in peripherial blood leukocytes of healthy human subjects. J.Infect.Dis. 171, 1060-1064, 1995.
13. Maitza S.K., Schotz M.C., Yoshikawa T.T., Guze L.B.// Defermination of lipid A and endotoxin in serum by mass-spectroscopy.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1978.-V.75.-P.3993.
14. Sugimoto C. et al.// Cellular fatty acid composition of Haemophilus equigenitalis.// J.Clin.Microbiol.- 1982.-Vol.15.-N5.-P.791-794.
15. Bronds J., Olsen J. //Chemotaxonomy at a crossroads? Gas chromatographic analysis of a single colony from the bacterium Haemophylus aphrophilus.// J.Chrom.,Biomed.Appl. -1986.-Vol.374.-N1.-P.119-124.
16. Dennemont J., Roupas A.,Heitz M. //Differentiation of Campylobacter jejuni, C.coli, C.lary and C.fetus fatty acid profiles obtained by gas chromatography - mass spectrometry and by their hippurate hydrolysis. Mitt. Geb.Lebensmittelunters.Hyg.- 1992.-Vol.83.-N2.-P.142-150.
17. meningococci in P.Brandzaeg and E.Jantzen article in J.Clin.Invest.,89,816-823,1992
18. Sud J.J., Feingold D.S. (1979) Detection 3-hydroxy fatty acids of picogram levels in biologic specimens. A chemical method of the detection of Neisseria gonorhoeae? - J.Investigative Dermatology. 73: 521-526
19. Chemical Methods in Bacterial Systematics (1985) (Goodfellow, M. and Minnikin, D.E., Eds.), Acad. Press, London - Toronto.
20. Chemical methods in Procariotic Systematics (1994) ( Goodfellow, M. and O’Donnell, A.G., Eds.), John Willey and Sons, .Chiduster, UK.
21. Brondz, J., Olsen, J.(1986) Microbial chemotaxonomy. Chromatography, electrophoresis and relevant profiling techniques. J. Chrom., Biomed. Appl. 379, 367-411
22. White, D.C. (1988) Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity. Adv. Limnol. 31, 1-18
23. Morgan, S.L., Fox, A., Gilbart, J. (1989) Profiling, structural characterization, and trace detection of chemical markers for microorganisms by gas chromatography - mass spectrometry. J.Microbiol.Methods. 9, 57-69.
24. Stead, D.E., Sellwood, J.E., Wilson, J., Viney, J. (1992) Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria. J.Appl.Bacteriol. 72, 315-321.
25. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж.Хоулта и др. М.Мир, 1997, т.1,2, 638с.
26. Weyant R.S., Moss C.W., Weaver R.E., Hollis D.G., Jordan J.G., Cook E.C., Daneshvar M.J. Identification of Unusual Pathogenic Gram-Negativ Aerobic and Facultatively Anaerobic bacteria. Second edition. Williams and Wilkins, 1996.
27. Zhilina T.N. Zavarzin G.A. Bulygina E.S. Kevbrin V.V. Osipov G.A. Chumakov K.M. // Ecology, physiology and taxonomic studies on a new taxon of Haloanaerobiaceae, Haloincola saccharolytica gen. nov., sp. nov. // Syst.Appl.Microbiol.-1992.-Vol.15.-P.275-284.
28. Zilina T.N., Zavarzin G.A., Rainey F.A., Pikuta E.N., Osipov G.A., Kostrikina N.A. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen.nov., sp.nov., an alkalophilic, sulfate-reducing bacterium. Int.J.Syst.Bact. Jan. 1997, Vol.47, No.1, p.144-149.
29. Цаплина И.А., Осипов Г.А., Богданова Т.И., Недорезова Т.П., Каравайко Г.И. Жирнокислотный состав липидов термоацидофильных бактерий рода Sulfobacillus. Микробиология, 1994, 63(5) 821-830.
30. Осипов Г.А. Недорезова Т.П. Ходорковская В.А. Свидин Ю.В.//Разработка экспресс-системы анализа состава сложных микробных сообществ с использованием масс-спектрометрических методов.// Отчет о выполнении НИР по ГНТП “Экология России”.-1992.-Проект №7.8.4.
31. Осипов Г.А. Демина А.М.//Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. //Вестник РАМН. -1996.-№2.//
32. А.Уайт и др. “Основы биохимии” в 3-х томах, 1981, Из-во Мир.
33. Alexander L.R., Justice J.B.Jr. Fatty acid composition of human erythrocyte membranes by capillary gas chromatography - mass spectrometry. J.Chrom.,Biomed.appl. -1985.-Vol.342.-P.1-12.
34. Маnual of Clinical Мicrobiology. 5-th ed. Editor in Chief - Albert Balows.Washington,1991, pp 8,
35. Hammann R. (1982) A Predessessment of the microbial flora of the female genital tract with special reference to the occurrence of Bacteroides spp. -J.Med.Microbiol. V.15, 3: 239-302 .
36. Bartlett J.G., Onderdonk A.B. et. al.(1977). Quantitative bacteriology of the vaginal flora. - J.infect. diseases. V.136, 2,
37. Большая медицинская энциклопедия, 1984, т........
38. Hamman см. 36
39. Brockman J, Hohne C. Bacteriological aspects of trichomonal vaginits. Zentraebl.gymahol.1979,101(11),722-26.
40. Person K. et al. Prevalence of 9 different microorganisms in the female genital tract. A comparison between women from a venerial decease clinic and from a health control department. Brit.J.Vener.Dis.,1979, 55(6), 429-33
41. Hammerschlag M.R., Alpert S et al. Microbiology of the vagina in children: normal and potentially patogenic organisms. Pediatrics, 1978, 62(10), 57-62.
42. Kabra S.K. Congenital tuberculosis. N.Engl.J.Med. 331(8), 548 (1994).
43. Колачевская Е.Н. Клиническое течение и диагностика женского генитального туберкулеза. Проблемы туберкулеза, 6, 26-29, 1994.
44. Голышевская В.И. Микробиологическая диагностика туберкулеза. Вестник РАМН. 7,16-18, (1995).
45. Cooper H.G. Transmission of M.tuberculosis via genital tract. J.Urol., 104(6), 914-915, (1970).
46. De Luca P. Latent female genital tuberculosis and sterility. Arch.Ostet.Ginecol. 87(5-6), 279-303, (1982).
47. Wilks M. 1984
48. Цвелев, 1995
49. Kozlowska, 1977
50. Раковская И.В.,Вульфович Ю.В. Урогенитальные микоплазмозы. Обзор. Медицина и зравохранение. Серия:” Акушерство и гинекол.”,1,1990.
51. Acunts K.B. Mycoplasma infections and human reproduction. Akysh.Gynehol.(Mosk.)1989,7 , 8-10
52. Hofstad T. Current toxonomy on medically importantnonsporing anaerobes. Rev.Infect.Dis.1990,12,Suppl.(122- 126)
53. Holst E. Reservoir of 4 organisms associated with bacterial vaginosis suggests lack of sexual transmission. J.Clin.Microbiol.1990, V.29 (9),p 2035
54. Lactobacillus FA
55. Nurminen M. (1985) Chemical characterization of Chlamydia trachomatis LPS. - Infection and Immunity. V48, 2: 573-75.
56. Bidavid,1989
57. Manual of Clinical Microbiology.5-th ed. 1991, p 317-318
58. Allugupalli S., Portaels F., Larsson L. Systematic study of the 3-hydroxy fatty acid composition of mycobacteria. J.Bacteriol. May 1994, 176(10), 2962-2969.
59. Asselineau C., Asselineau J. (1990) Lipid analysis in bacterial taxonomy proposal for a standardized method. -Biochem.Cell Biol. V 68 (1):379-86
60. Luquin M. et.al. (1991) Evalution of practical chromatographic procedures for identification of clinical isolates of Mycobacteria. - J.Clin.Microb., V 29 (1):120-30
61. Jantzen E., Tangen T., Eng I. (1989) GC of Mycobacterial FA and alcohols: diagnostic application. - Apmis, 97 (11):1037-45
62. Mott G.E., Brinkley A.W. Plasmonylethanolamin: growth factor for cholesterol-reducing Eubacterium. J.Bacteriol., 1979,139(3),755-760
63. Nichols P.D., Leeming R., Rayner M.S., Latham V. (1996). Use of capillary gas chromatography for measuring fecal-derived sterols. J.Chrom.,A 733, 497-509.
64. Gailly G., Sandra P., Verzele M., Cociti C. Analysis of mycolic acid from a group of corinebacteria by capillary gas chromatography and mass spectrometry. Eur.J.Biochem. 125(1), 83-94, 1982.
65. Herrera-Alcaras E., Valero-Guillen P., Martin-Luengo F., Canteras-Jordana M. (1993). Numerical analysis of fatty and mycolic acid profiles of Corynebacterium urealyticum and other related corynebacteria. - Microbiologia Sem.,9, 53-62.
66. Moss C.W., ... J.Clin.Microbiol. 1977
67. Lambert M.A. .... J.Clin.Microbiol. 1979
68. Moss, Pseudomonas
69. Осипов Г.А. Шабанова Е.А. Бабайцева В.А. Недорезова Т.П. Ходорковская В.А. Истратов В.Г., Сергеева Т.И. Чирикова Е.В. // Способ диагностики клостридиальной анаэробной газовой инфекции.// Патент РФ №2021608 кл.G01N 33/50.- Зарегистрировано в гос.реестре 15.10.94.- Бюл.№19
70. Koichi T. // On the production of hydroxy fatty acids and fatty acids oligomers in the course of adipocere formation.// Nippon Hoigaku Zasshi.-1984.-Vol.38.-No.3.-P.257-272.
71. Клостридии
72. Mayberry W.R., Lambe D.W.,Jr.; Ferguson H.P.// Jdentification of Bacteroides species by cellular fatty acid profiles.// Int.J.Syst.Bacteriol.-1982.-Vol.32(1).-P.21-27.
73. Brondz I., Olsen I. (1991) Multivariate analyses of cellular fatty acids in Bacteroides, Prevotella, Porhyromonas, Wolinella and Campylobacter spp. - J.Clin.Microb., V 29 (1) :183-89
74. Tsuchiya H., Masaru S., Kato M. et al., High-Perfomance Liquid Chromatographic analysis of bacterial fatty acid composition for chemotaxonomic characterization of oral streptococci. J.Clin.Microbiol., 1986, 24(1), 81-85.
75. Седов В.И., Пинчук Л.М. Состав высших жирных кислот энтерококков. Журн.Микроб.Эпидем.Иммун., 1982, 9 ,49-59
76. Larsson, грибы, эргостерол
77. Reina J, Gil J, Salva F,Gomez J, Alomar P. Microbiological characteristics of Weeksella virosa (formerly CDC group Iif ) isolated from the human genitourinary tract. J.Clin.Microbiol. 1990, 28 (10) :2357-2359
78. Белокрысенко, патология флавобактерий
79. Dees S.B., Moss C.W., Hollis D.G., Weaver R.E. Chemical characterization of Flavobacterium odoratum, Flavobacterium breve, and Flavobacterium-like groups IIe, IIh, and IIf. J.Clin.Microbiol. 23(2), 267-273, 1986.
80. Werder E.A. Neonatal infections with Streptomyces pelletieri. Am.J.Dis.Child. 125(3), 439-441 (1973).
81. Jantzen E., Bryn K., Hagen N., Bergan T., Bovre K. Cellular fatty acid composition of Francisella tularensis.J.Clin.Microbiol. 12, 928-930, 1979.
82. Geis G., Leying H., Suerbaum S., Opferkuch W. Unusual fatty acid substitution in lipids and lipopolysaccharides of Helicobacter pylori. J.Clin.Microbiol. 28(5), 930-932, 1990.
83. Jantzen E., Bryn K., Hagen N., Bergan T., Bovre K. Fatty acids and monosaccharides of Neisseriaceae in relation to established taxonomy. National Institute of Public Health (NIPH). Annals. 1(2), 59-71, 1978.
84. Miyagawa E., Azuma R., Suto T. Cellular fatty acid composition in gram-negative obligately anaerobic rods. J.Gen.Appl.Microbiol. 25, 41-51, (1979).
85. Jantzen E., Berdal B.P., Omland T. Fatty acid taxonomy of Haemophilus species, Pasteurella multocida, Actinobacillus actino-mycetemcomitans and Haemophilus vaginalis (Corinebacterium vaginale). Acta Path.Microbiol.Scand., 88B, 89-93.
86. Следует продолжение

Рисунки (будут добавлены при обновлении страницы)

1. Хроматограммы жирнокислотной фракции мочи (1), вагинального содержимого (2) и семени (3). Обозначения пиков в соответствии с табл.1.
2. Рис.2 . Измененние концентрации жирных кислот в в биологических жидкостях урогенитального тракта. Незаштрихованная область представляет разницу между максимальным и минимальным содержанием вещества у людей без выраженного воспалительного процесса. А - жирные кислоты организма-хозяина, В - предполагаемые микробные компоненты.
3. Рис.. Точечная диаграмма диапазона концентраций минорных жирных кислот - предполагаемых маркеров микроорганизмов в моче мужчин.
4. Рис.. Точечная диаграмма диапазона концентраций минорных жирных кислот - предполагаемых маркеров микроорганизмов в вагинальном содержимом.
5. Рис.. Точечная диаграмма диапазона концентраций минорных жирных кислот - предполагаемых маркеров микроорганизмов в семени.
6. Рис. Распределение концентраций некоторых маркеров микроорганизмов в билогических жидкостях УГТ. А....Б....В...
7. Кластеры значений концентраций некоторах маркеров микроорганизмов в билогических жидкостях УГТ. А....Б....В...