Субпопуляции лимфоцитов периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом
|
Словарь сокращений
ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат ФЭ – фикоэритрин ГКГС – главный комплекс гистосовместимости ЕК-клетки – естественные киллерные клетки ТКР – рецептор Т-клеток Наружный генитальный эндометриоз является важной проблемой современной гинекологии, так как, несмотря на совершенствование в течение последнего десятилетия методов диагностики и лечения, заболевание остается одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста: заболевание поражает 15–20% женщин в возрасте 20–35 лет [4]. Вопрос об этиологии и патогенезе эндометриоза, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза. У пациенток с эндометриозом выявляются значительные изменения как на системном (увеличение содержания Т-, ЕК-лимфоцитов в периферической крови), так и на локальном (возрастание количества лимфоцитов, нарушение функциональной активности естественных киллерных клеток (ЕК-клеток) в перитонеальной жидкости) уровнях [8, 14]. При этом большинство авторов рассматривают смешанную группу больных эндометриозом, куда входят пациентки со всеми стадиями заболевания. В настоящем исследовании мы изучали содержание лимфоидных клеток и их фенотипы в периферической крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ) женщин с эндометриозом в зависимости от степени распространенности заболевания. Материал и методы В настоящее исследование вошло 40 пациенток, проходивших обследование и лечение в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу наружного генитального эндометриоза, и 17 соматически здоровых женщин с нормальной репродуктивной функцией, поступивших в центр для проведения хирургической стерилизации (группа контроля). Пациентки с наружным генитальным эндометриозом были разделены на две группы, сформированные на основе диагноза. В 1-ю группу вошли женщины с I–II степенью распространенности эндометриоза (по классификации Американского общества фертильности), во 2-ю группу – с III–IV степенью распространенности. Материалом для исследования служили клетки ПК и ПЖ пациенток с эндометриозом и женщин контрольной группы. ПК получали из локтевой вены обследуемых лиц в асептических условиях в пробирки, содержавшие 0,5 мл раствора гепарина в среде 199 (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). Выделение мононуклеарных клеток (МНК) проводили центрифугированием на градиенте плотности фиколла (Lymphocyte Separation Medium, Flow Laboratories, США, r=1,077 г/см2). ПЖ собирали во время проведения оперативной лапароскопии по поводу эндометриоза либо стерилизации по Zemm. ПЖ собирали из дугласова и переднематочного пространства непосредственно после вхождения в полость малого таза, до начала лапароскопических манипуляций для предотвращения попадания в ПЖ крови. Геморрагические образцы перитонеальной жидкости не исследовали. ПЖ собирали в стерильные гепаринизированные пробирки (Falcon, США) при комнатной температуре и максимально быстро доставляли в лабораторию [15]. Мононуклеарные клетки (МНК) ПЖ выделяли аналогично выделению МНК крови. Выделенные МНК ПК и ПЖ окрашивали для последующего анализа на проточном цитофлуориметре, используя моноклональные антитела: Anti-Leu-4 (CD3), Anti-Leu-3a (CD4), Anti-Leu-2a (CD8), Anti-Leu-11b (CD16), Anti-Leu-12 (CD19), Anti-TCRgd («Bekton Dickinson», США). Для контроля неспецифического связывания моноклональных антител использовали соответствующие контроли изотипов иммуноглобулинов («Bekton Dickinson», США), меченные ФИТЦ и ФЭ. Фенотипирование лимфоцитов ПК и клеток ПЖ проводили на проточном цитофлюориметре (Bio-Rad, Италия). Из каждой пробы анализировали 5000 жизнеспособных клеток, дискриминируемых по интенсивности свечения пропидиума йодида. Cтатистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel», достоверность межгрупповых различий определялась по t-критерию Стьюдента. Данные представлены в виде среднего±ошибка среднего (М±m). Результаты В ПК женщин с III-IV степенью эндометриоза обнаружено достоверное снижение общего количества Т-лимфоцитов, а также выраженное повышение процентного содержания В- и ЕК-клеток (р меньше 0,01). По этим показателям были зафиксированы также межгрупповые различия. Изменения в клеточном звене иммунитета у женщин с малыми формами эндометриоза выражались в снижении содержания клеток CD8+ фенотипа и увеличении относительного количества gd-Т-клеток (табл. 1). Таблица 1. Относительное содержание (в % ) основных клеточных популяций в ПК женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы (M±m)
Примечание. Здесь и в табл. 2: a — статистически значимые различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с соответствующим контролем: p меньше 0,05; b — p меньше 0,01; c — статистически значимые различия между группами эндометриоза, p меньше 0,05. Таблица 2. Относительное содержание (в %) основных клеточных популяций в ПЖ женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы
Известно, что величина «индекса иммунорегуляции» (CD4/CD8) является важным показателем гармоничной функции иммунной системы. Как следует из представленных данных, у больных эндометриозом I–II стадии отмечается тенденция к увеличению этого показателя, по-видимому, за счет снижения содержания клеток CD8+. При сравнении содержания лимфоцитов в ПЖ пациенток с эндометриозом и здоровых женщин не выявлено различий в относительном количестве В-клеток (CD19+) и ЕК-лимфоцитов (CD16+), тогда как во 2-й группе в Т-клеточном звене было обнаружено значительное увеличение как общего количества Т-лимфоцитов, оцениваемого по содержанию клеток CD3+, так и повышение содержания клеток регуляторных субпопуляций – хелперов/индукторов (CD4+) и супрессоров/цитотоксических (CD8+) (табл. 2). Данные различия оказались статистически достоверными при сравнении с результатами анализа не только в контроле, но и в 1-й группе. В 1-й группе исследования не отмечено изменения содержания Т-лимфоцитов, за исключением клеток, экспрессирующих gd-Т-клетки. Обсуждение результатов Исследованию популяций лимфоцитов ПК при эндометриозе было посвящено много работ, так как известно, что патологические изменения в органах и тканях, содержащих большое количество иммунокомпетентных клеток, могут вызывать значительные изменения в клеточном составе ПК [17], и путем оценки субпопуляционного состава лимфоцитов ПК можно получить информацию о состоянии иммунной системы в целом. При фенотипировании лимфоцитов ПК пациенток с разной степенью эндометриоза выявлены следующие нарушения иммунитета в группах: при малых формах содержание супрессорно-цитотоксической субпопуляции Т-клеток (CD8+) изменялось в сторону снижения, вследствие чего имеет место увеличение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, кроме того, отмечалось увеличение процента gd-Т-клеток. При III–IV степени эндометриоза были обнаружены другие изменения – повышение содержания В-клеток и ЕК-лимфоцитов. Увеличение содержания ЕК-клеток, ответственных за уничтожение попавших в перитонеальную полость путем ретроградного заброса менструальной крови [9], может быть немаловажным фактором при данном заболевании. Учитывая, что при эндометриозе, с одной стороны, происходит увеличение содержания ЕК-клеток, а, с другой – снижение ЕК-активности [10, 14], можно предположить функциональный дефект этого звена иммунитета. Уменьшение относительного количества клеток фенотипа CD3+, зафиксированное в группе женщин с III–IV степенью эндометриоза, по-видимому, происходит вследствие снижения содержания обеих (CD4+ и CD8+) иммунорегуляторных субпопуляций, поэтому иммунорегуляторный индекс не изменялся. Таким образом, результаты фенотипирования лимфоцитов ПК подтвердили ранее выявленные нарушения клеточного звена иммунитета у больных эндометриозом [2, 5, 15], которые различны по проявлениям у женщин с разной степенью заболевания. Как и предполагалось, значительно более выраженные изменения в функционировании иммунной системы обнаруживаются на уровне локальном, в непосредственной близости от имплантатов – в ПЖ. Последняя, представляющая микроокружение очагов эндометриоза, содержит как множество растворимых факторов, влияющих на процесс имплантации и роста эндометриоидных эктопий, так и большое количество клеточных элементов, эти факторы продуцирующих [10, 13]. Существует много работ, указывающих на нарушения в клеточном иммунитете при эндометриозе. Нами показано, что В-клетки представлены в ПЖ как больных эндометриозом, так и здоровых женщин в очень незначительном (1–2%) количестве. Выявленные изменения иммунитета на локальном уровне касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания клеток хелперной субпопуляции (CD4+) и относительного содержания gd-Т-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости [3, 7]. Увеличение при эндометриозе содержания Т-лимфоцитов, в активированном состоянии вырабатывающих спектр цитокинов и факторов роста, в свою очередь способных усиливать рост эндометриоидных клеток in vitro [11], предполагает нарушения в регуляции иммунного ответа. В последние годы выявлены многочисленные биохимические различия эндометриоидной ткани с эутопическим эндометрием, вследствие чего эктопический эндометрий может быть процессирован антиген-презентирующими клетками и представлен Т-лимфоцитам [16]. «Антигенность» собственного эндометрия, имплантировавшегося в перитонеальной полости и вызвавшего заболевание, подтверждает также увеличение содержания на начальных этапах заболевания gd-Т-лимфоцитов, клеток, которые, как известно, независимы от главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и способны быстро распознавать антиген и реагировать на него [12]. В то же время повышенное количество gd-Т-лимфоцитов определяется у больных аутоиммунными заболеваниями, например, с синдромом Сьогрена [6], что также косвенно подтверждает возможность аутоиммунных нарушений, которые описывают многие исследователи, у больных эндометриозом. По-видимому, вслед за активацией иммунных процессов на начальных стадиях заболевания на более поздних воспалительный процесс, развивающийся в ответ на присутствие эндометриоидной ткани в перитонеальной полости и из-за невозможности удаления очагов эндометриоза, прогрессирует, в результате чего возникают инфильтрация, фиброз и инкапсуляция очагов эндометриоза [1]. Это подтверждается результатами нашего исследования, в ходе которого были выявлены изменения в Т-клеточном звене иммунитета при III–IV степени эндометриоза. Все вышеуказанные нарушения в иммунной системе, по-видимому, являются важным звеном в патогенезе эндометриоза. Понимание иммунных процессов, происходящих при эндометриозе как на локальном, так и на системном уровнях, несомненно, позволит найти новые методы диагностики и лечения этого заболевания. Д.В. Куявская, К.В. Григорян, С.Ф. Торубаров, Г.Т. Сухих Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва Литература 1. Баскаков В.П. Клиника и лечение эндометриоза. Л Медицина 1990; 240. 2. Старцева Н.В. Клинико-иммунологические аспекты генитального эндометриоза. Акуш и гинек 1980; 3: 23. 3. Badaway S., Cuenca V., Freliech H. Endometrial antibodies in serum and peritoneal fluid of infertile patients with and without endometriosis. Fertil Steril 1990; 53: 930–932. 4. Barbieri R.L. Etiology and epidemiology of endometriosis. Amer J Obstet Gynecol 1990; 162: 2: 565–567. 5. Dmowski W.P. Immunological aspects of endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 1995; 50: Suppl 1: 3–10. 6. Gerli R., Agea E., Muscat C. et al. Functional characterization of bearing the gamma-delta T-cell receptor in patients with primary Sjogren’s syndrome. Clin Exp Rheumatol 1993; 11(3): 326. 7. Halme J., Becker S., Haskill S. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: possible role in pathogenesis of endometriosis. Am J Reprod Immunol 1987; 156: 783–788. 8. Haney A., Muscat J., Weinberg J. Peritoneal fluid cell populations in infertility patients. Fertil Steril 1981; 35: 696–699. 9. Hill J.A., Heidi M.P., Schiff I., Anderson D.J. Characterization of leucocyte subpopulations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 1988; 50(2): 216–223. 10. Ho H.-H., Chao K.-H., Chen H.-F. et al. Peritoneal natural killer cytotoxicity and CD25+CD3+ lymphocyte subpopulation are decreased in women with stage III-IV endometriosis. Hum Reprod 1995; 10: 10: 2671–2675. 11. Hornung D., Ryan I.P., Chao V.A. et al. Immunolocalization and regulation of the chemokine RANTES in human endometrial end endometriosis tissues and cells. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82(5): 1621–1628. 12. Kaufmann S.H. gd and other inconventional T lymphocytes: What do they see and what do they do? Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93: 2272-2279. 13. Kubicka U., Olszewski W.L., Tarnowski W., Bielecki K., Ziolkowska A., Wierbicki Z. Normal Human Immune Peritoneal Cells: Subpopulations and Functional Characteristics. Scand J Imminol 1996; 44: 157–163. 14. Oosterlynk D.J., Meuleman C. et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril 1992; 58: 2: 290. 15. Oosterlynk D.J., Meuleman C., Lacquet F.A. Flow Cytometry analysis of lymphocyte subpopulation in peritoneal fluid of women with endometriosis. Am J Reprod Immunol 1994; 31(1): 25–31. 16. Ota H., Igarashi S. Expression of major histocompatibility complex class II antigen in endometriotic tissue in patients with endometriosis and adenomiosis. Fertil Steril 1993; 60(5): 834–838. 17. Westermann J., Pabst R. Lymphocyte subsets in the peripheral blood: diagnostic window on the lymphoid system? Immunology Today 1990; 11: 11: 406–409. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||