Идентификация кольцевой и маркерной хромосом при типичных формах дисгенезии гонад

Нарушения половой дифференцировки представляют собой обширную группу заболеваний с высокой клинической вариабельностью и генетической гетерогенностью. Характерными признаками этих заболеваний являются количественные и структурные аберрации половых хромосом, а также несоответствие фенотипа генетическому полу (набору половых хромосом) индивида. Наиболее распространенной патологией среди этой группы заболеваний является типичная форма дисгенезии гонад, или синдром Шерешевского-Тернера. Частота рождения больных детей составляет 1:1500 девочек [1]. При цитогенетическом исследовании у больных с типичной формой дисгенезии гонад обнаружен широкий спектр кариотипов: с количественными нарушениями комплекса половых хромосом - Х0, Х0/ХХ, Х0/ХY и др., и структурными нарушениями одной из хромосом - Х или Y, входящих в этот комплекс: делеции, кольцевые хромосомы, изохромосомы по длинному плечу и др. Несмотря на разнообразие генотипов, подавляющее большинство больных с синдромом Шерешевского-Тернера причисляют к лицам женского пола, в связи с тем, что из всех больных, имеющих хромосому Y в кариотипе, женский пол присваивается в 60% [2]. Наличие хромосомы Y в кариотипе у таких "девочек" часто сопровождается малигнизацией гонад, что требует высокой онкологической настороженности. Установлено, что опухоли дисгенетичных гонад у этих больных до 16 лет выявляются в 10,2% случаев; во второй и третей декадах жизни процент этот возрастает до 30-35 [3]. Однако ряд авторов обнаружили возникновение гонадобластом и дисгермином в раннем детском возрасте, что свидетельствовало о перерождении гонад еще в период внутриутробного развития. В связи с этим обнаружение хромосомы Y в кариотипе имеет важное значение для лечения и прогноза заболевания. По данным Saenger (1993) [цит. по 1], хромосома Y в кариотипе обнаруживается только у 6% больных с синдромом Шерешевского-Тернера при использовании дифференцированной окраски. В ряде случаев присутствие в кариотипе больных отдельных фрагментов хромосом не позволяет определить их принадлежность к хромосомам Х или Y. Поэтому в последнее время для идентификации этих фрагментов стали применять молекулярно цитогенетический метод FISH-анализа, в основе которого лежит гибридизация in situ. В настоящей статье представлены два клинических наблюдения больных с типичной формой дисгенезии гонад и мозаичными вариантами кариотипа. В первом случае у пациентки в кариотипе был обнаружен клон с кольцевой хромосомой. В кариотипе второй пациентки присутствовала маркерная хромосома небольшого размера. Кольцевую и маркерную хромосому невозможно было идентифицировать цитогенетическим методом с применением дифференцированной окраски. У обеих больных в кариотипе доминирующим клеточным клоном был клон 45,Х. Наблюдение 1 Пациентка впервые была обследована в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН в возрасте 14 лет в связи с отставанием в росте и задержкой полового развития. Рост 138 см, масса 36 кг. Степень полового развития соответствовала: Ах0 Ма0 Р1 Меabs. Девочка имела тернероидный тип сложения: широкая грудная клетка с широко расставленными втянутыми сосками, укороченная шея, cubitus valyus. Обнаружены и другие стигмы, типичные для данной патологии: высокое небо, эпикант, невусы на туловище, укорочение IV пальца обеих стоп, дистрофия ногтей, припухлость тыльной поверхности стоп. Костный возраст отставал от хронологического на 4 года. При ультразвуковом исследовании внутренних половых органов матка и гонады имели вид тяжей. Гормональные исследования обнаружили высокие концентрации гонадотропинов в крови: ЛГ - 38 МЕ/л, ФСГ - 183 МЕ/л и низкий уровень эстрадиола - 63 пмоль/л. Цитогенетическое исследование выявило мозаицизм. Один клеточный клон был представлен моносомией по Х-хромосоме 45,Х. Другой имел 46 хромосом, одна из которых имела вид кольца. G-окраска позволила идентифицировать 45 хромосом, все аутосомы и хромосому Х. Принадлежность кольцевой хромосомы к Х или Y установить не удалось (рис. 1). Клон клеток, содержащих 45,Х, составил 86%, а клон клеток, содержащих 46,Хr - 14%. Рис. 1. Кариотип пациентки (наблюдение 1) Наблюдение 2 Впервые пациентка была обследована в поликлинике Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН в возрасте 13 лет в связи с задержкой полового развития и отставанием в росте. Рост 134.5 см, масса 28.5 кг. Степень полового развития соответствовала: Ах0 Ма0 Р1 Меаbs. Девочка имела широкую грудную клетку с широко расставленными сосками, а так же ряд стигм: высокое небо, дистрофию ногтей, на коже туловища массу невусов, укорочение IV пальца правой ступни из-за отсутствия средней фаланги. Со стороны внутрених органов обнаружена гипоплазия почек. Костный возраст соответствовал 10-10,5 годам. Ультразвуковое исследование выявило матку и гонады в виде тяжей. Гормональные исследования показали высокую концентрацию ФСГ - 100,3 МЕ/л и низкую концентрацию эстрадиола - 43 пмоль/л в крови. При цитогенетическом исследовании лимфоцитов крови обнаружено два клона клеток. Один клеточный клон был представлен моносомией по Х хромосоме 45,Х. Другой имел 46 хромосом, одна из которых была представлена фрагментом от неизвестной хромосомы и имела вид маленькой хромосомы, по размерам напоминающую группу G. С помощью G-окраски удалось идентифицировать 45 хромосом, все аутосомы и хромосому Х. Принадлежность фрагмента хромосомы к Х или Y установить не удалось (рис. 2). Процент клеток содержащих кариотип 45,Х составил 83, а содержащих 46,Х + mar - 17%. Рис. 2. Кариотип пациентки (наблюдение 2) Для идентификации кольцевой и маркерной хромосом был использован метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) модифицированный Ю.Б. Юровым и С.Г. Ворсановой [4]. Принцип метода основан на специфической гибридизации флюоресцентно меченных зондов с определенными участками хромосом (обычно это расположенные в районе центромеры хромосомоспецифические альфоидные повторы). По флюоресценции зондов можно быстро детектировать число копий хромосомы и структурные перестройки в интерфазных ядрах. Этот метод позволял избежать ошибок в определении пола при наличии маркерной хромосомы Y [5]. Для диагностики половых хромосом были использованы отечественные флюоресцентно меченные альфоидные зонды к хромосомам Х и Y. Эти ДНК-зонды были получены в лаборатории цитогенетики НЦ ПЗ РАМН. ДНК зонд для хромосомы Х был помечен прямым флуорофором - оранжевым Су3. ДНК-зонд для хромосомы Y был помечен биотином. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 (Zeiss), оснащенном соответствующим набором светофильтров (фильтры № 01, 09, 15). В первом наблюдении исследовано 200 лимфоцитов, с применением метода FISH анализа. В результате обнаружено 2 клеточных клона. Один клеточный клон - 88% имел один флюоресцентный сигнал, которым был помечен зонд на хромосому Х, другой - 12% имел 2 идентичных сигнала (рис. 3). Рис. 3. FISH-анализ лимфоцитов пациентки (наблюдение 1) Анализ результатов исследования лимфоцитов больной методом FISH показал, что кольцевая хромосома является дериватом хромосомы Х. Таким образом, кариотип больной был 45,Х/46,Хr(X). Во втором наблюдении исследовано 400 лимфоцитов, так как было обнаружено 3 типа клеток, различающихся между собой по количеству сигналов в ядрах, принадлежащих зонду хромосомы Х. 70% ядер имели один флюоресцентный сигнал, 30% - два одинаковых сигнала и только 2 клетки из 400 имели 3 сигнала, указывающих на наличие хромосомы Х (рис. 4). Учитывая факт присутствия в крови больной 3 типов клеток с разным количеством Х-сигналов, можно было предположить о наличии сложного мозаицизма. Однако слишком маленький процент клеток с 3 сигналами не исключал присутствия артефакта. Анализ результата исследования лимфоцитов пациентки методом FISH показал, что маркерная хромосома являлась дериватом хромосомы Х. Учитывая небольшие размеры этой хромосомы, установить точно места (границы, точки) делеции не удалось. Полученные данные свидетельствовали, что кариотип больной имел формулу 45,Х/46,Х micro (Х). Рис. 4. FISH-анализ лимфоцитов пациентки (наблюдение 2) Флюоресцентная гибридизация, позволяющая исследовать не только метафазные хромосомы, но и интерфазные ядра, является методом быстрой цитогенетической диагностики. Использование флюоресцентной гибридизации при анализе кариотипа у больных с нарушением половой дифференцировки продемонстрировало преимущество метода, так как способствовало идентифицированию комплекса половых хромосом в клеточном клоне, где одна из хромосом была представлена мелким фрагментом. Ж.И. Глинкина, И.Г. Дзенис, Б.В. Леонов, Г.И. Мушакова, В.А. Бахарев Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва Литература 1. Осипова Г.Р. Исследование гена SRY при некоторых нарушениях детерминации пола (ХY "чистой" форме дисгенезии гонад, синдроме Шерешевского-Тернера, ХХ инверсии пола). Дис. … канд. мед. наук. М 1997. 2. Colston Wents A. Congenital anomalies and Intersexualiti. Textbook of gynecology. Baltimore 1988; 156-157. 3. Розовский И.С., Дзенис И.Г. и др. Клинико-морфологическая характеристика больных с гонадальным дисгенезом, женским фенотипом и наличием Y-хромосомы в кариотипе. Медико-генетические исследования в акушерстве и гинекологии. М 1977; 136-143. 4. Yurov Y.B., Soloviev I.V., Vorsanova S.G. et al. Hight resolution multicolor fluorescence in situ hybridization using cyanine and fluorescein dyes: rapid chromosome identification by directly fluorescently labeked alphoid DNA probes. Hum Genet 1996; 97: 390-398. 5. Tkachuk D.S., Pinkel D., Kuo W-L., Weier H-U., Grey J.W. Clinical applications of fluorescence in situ hybridization. Genet Anal Tech Appl 1991; 8: 67-74.