Форум РМС

Лечение в Москве - 8 (495) 506 61 01

Лечение за рубежом - 8 (925) 50 254 50

Приготовление человеческих сперматозоидов в программах ВРТ.

Качество половых клеток - один из наиболее важных факторов для развития эмбриона и определения вероятности успеха во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Трудно получить эмбрионы хорошего качества из плохо подготовленных ооцитов и сперматозоидов. Полноценность спермального хроматина не может быть оценена методом быстрой световой микроскопии, тогда как другие факторы, такие, например, как подвижность сперматозоидов, поддаются экспресс-анализу под световым микроскопом, однако не всегда соответствуют оплодотворяющей способности спермы или возможности обеспечивать дальнейшее развитие в зиготу [12]. Поэтому важно использовать такую технологию обработки спермы, которая гарантированно позволит отобрать нормальные, функционально активные сперматозоиды из общей имеющейся в наличии популяции.

Образец семени (эякулят) состоит из семенной жидкости (плазмы), сперматозоидов, иммунных и эпителиальных клеток, клеточного дебриса и бактерий. Вирусное обсеменение тоже может иметь место. Каждый из этих компонентов оказывает значительное влияние на выживаемость сперматозоидов (табл. 1), иногда даже до такой степени, что может происходить полная потеря их оплодотворяющей способности после 30-минутного пребывания в семенной плазме.

In vivo подвижные сперматозоиды быстро мигрируют из разжижающегося эякулята в шейку матки, в процессе чего освобождают себя от остатков семенной плазмы и реакционногенных соединений кислорода, возникающих из клеточного дебриса, и погибающих сперматозоидов. Через шейку матки сперматозоиды быстро распространяются по всему женскому репродуктивному тракту и достигают отдел, где происходит оплодотворение. В андрологической лаборатории этот процесс отделения подвижных сперматозоидов от остатков эякулята может имитироваться использованием как метода swim-up, так и метода центрифугирования в градиенте плотности. Эти две технологии являются наиболее широко применяемыми в ВРТ [39]. Иногда необходимо эксплуатировать оба этих метода, например, при обработке контаминированных вирусами эякулятов (см. ниже).

Таблица 1. Компоненты семенной плазмы и их влияние на жизнеспособность сперматозоидов


Использование технологии обработки спермы, в процессе которой эффективно выделяются функционально активные сперматозоиды из эякулята, - это необходимое условие успеха во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Хотя метод swim-up увеличивает процент содержания подвижных сперматозоидов в процессе обработки эякулята, однако не отделяет ни морфологически деформированные, ни сперматозоиды с нарушенным хроматином. В процессе swim-up не удаляются бактерии и вирусы, тогда как присутствие продуцируемых бактериями эндотоксинов, реакционноактивных соединений кислорода из клеток, мертвых или погибающих сперматозоидов, оказывает губительное действие на выживаемость всех сперматозоидов.

Хотя технология центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности была впервые разработана в 1996 г. с использованием Percolltm («KABI Pharmacia», Швеция) в качестве коллоида [6], его применение было ограничено производителем только для исследовательских целей. Поэтому клиники ЭКО должны быть осведомлены, что Percolltm не лицензирован для клинического использования. С тех пор, как имеются в наличии лицензированные материалы, такие как PureSperm («Nidacon International AB», Швеция), клиники могут столкнуться с риском судебного преследования, если они продолжают применять нелицензированные продукты [28].

Помимо лицензирования для клинического использования, PureSperm обладает несколькими преимуществами перед Percolltm как материал для приготовления спермы методом центрифугирования в градиенте плотности. Если Percolltm состоит из частиц двуокиси кремния, связанных с поливинилпиролидоном (ПВП) в воде, и к нему необходимо добавлять специальный солевой раствор перед использованием, PureSperm содержит силансвязанные частицы двуокиси кремния в HEPES-забуференном сбалансированном растворе солей, который поддерживает жизнеспособность сперматозоидов во время центрифугирования. Более того, присутствие HEPES в качестве буфера оказывает антиоксидантное действие. PureSperm стерилизуется в процессе производства автоклавированием и имеет сверхнизкий уровень эндотоксинов; Percolltm не может быть автоклавирован и имеет значительные колебания в содержании эндотоксинов от партии к партии, что приводит к невозможности использования некоторых партий для обработки сперматозоидов.

Присутствие ПВП в Percolltm является основанием для беспокойства. Как докладывалось, ПВП служит причиной субмикроскопических изменений [37], его использование для замедления движения сперматозоидов перед процедурой ИКСИ вызывает несвоевременную деконденсацию спермального хроматина [10] и снижение процента оплодотворения [17]. Некоторые клиники вообще избегают применять ПВП [13] и сообщают в результате о повышении оплодотворяемости ооцитов и улучшении качества эмбрионов [25].

Центрифугирование в градиенте плотностис использованием PureSperm

PureSperm состоит из коллоидного раствора двуокиси кремния в сбалансированном, забуференном HEPES растворе солей. Производителем рекомендуется двухслойный градиент, включающий 40 и 80% PureSperm. Градиент может создаваться за счет разбавления PureSperm буфером PureSperm Buffer или использованием готовых к употреблению PureSperm 40 и PureSperm 80. Эякулят осторожно, не нарушая разделение слоев, наслаивается на градиент, так как его повреждение снижает эффективность сепарации. Протокол использования PureSperm изображен на схеме 1.

Градиент центрифугируется при 300 g в течение 20 мин, после чего осадок из наиболее подвижной фракции сперматозоидов легко заметен на дне конической центрифужной пробирки. Следующий этап заключается в осторожном удалении пастеровской пипеткой эякулята, а также верхнего и большей части нижнего слоев градиента, после чего осадок отбирается новой стерильной пастеровской пипеткой. Центрифугат затем переносится в новую центрифужную пробирку для отмывания остатков коллоидного раствора.

Существенно важно отделить спермальный осадок вышеописанным способом и перенести в чистую центрифужную пробирку. Использование для отмывания осадка той же центрифужной пробирки, что применялась для создания градиента, приводит к загрязнению суспензии сперматозоидов бактериями и другими компонентами семенной жидкости. Если градиент плотности был выполнен правильно, согласно вышеизложенной инструкции, осадок должен содержать только функционально активные подвижные сперматозоиды. Они могут быть использованы для внутриматочной инсеминации, экстракорпорального оплодотворения или метода ИКСИ.

Метод swim-up

Среда для метода swim-up ReadySwimtm («Nidacon International AB», Швеция) наслаивается на аликвоту уже разжиженного эякулята в центрифужной пробирке (схема 2), которая затем ставится в термостат под углом примерно в 45°. После инкубирования в течение 1 ч при 37 °С отбирается около 1 мл суспензии и центрифугируется до образования осадка из сперматозоидов, которые затем ресуспендируются в подходящей среде для использования при внутриматочной инсеминации, ЭКО или ИКСИ.



Схема 1. Обработка спермы методом центрифугирования в градиенте плотности PureSperm.

Замечание: рекомендуется для обработки каждого эякулята готовить два градиента.


Схема 2. Проведение метода swim-up с использованием ReadySwim.

Сравнение двух методов для приготовления сперматозоидов

По сути, метод swim-up отделяет сперматозоиды от остального состава эякулята исключительно на основании их подвижности. Поэтому малоподвижные сперматозоиды могут попадать в среду вместе с активно подвижными, как и сперматозоиды с морфологическими дефектами и поврежденной ДНК. Даже бактерии и вирусы могут преодолевать барьер между эякулятом и средой. Выявлено высокое содержание бактерий в готовой взвеси сперматозоидов, полученной при использовании среды без антибиотиков [20]. Более того, возможно загрязнение реактогенными соединениями кислорода. Содержание большого количества таких соединений приводит к нарушению оплодотворяющей способности спермы [3].

Напротив, центрифугирование в градиенте плотности фракционирует клеточные популяции в соответствии с их плотностью и подвижностью. В процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, другими словами, к их изопикнической точке [27]. Поэтому сперматозоиды с неповрежденной ДНК находятся в прямой зависимости от доли сперматозоидов с интактной ДНК [38].

Таблица 2. Сравнение методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и swim-up


Посторонние клетки, например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же как мертвые и погибающие сперматозоиды, служат источником реакционногенных видов кислорода. В маленьком количестве они необходимы сперматозоидам для модулирования генной и белоксинтезирующей активности в процессе собственной дифференцировки и функционирования. Однако когда содержание реакционногенных видов кислорода превышает норму, происходит необратимое повреждение спермального хроматина, которое ведет к нарушению фертилизационного потенциала и некрозу спермиев (Aitken & Clarkson, 1988). Отрицательное воздействие реакционногенного кислорода на функциональную полноценность хроматина было задокументировано и подробно описано в работах [12]. Одновременное удаление сперматозоидов с поврежденным хроматином и источников реакционногенных видов кислорода должно смягчить воздействие их высокой концентрации на образцы спермы в процессе ее обработки.


Контроль контаминации

Наличие бактерий в эякуляте может оказывать прямое влияние на оплодотворяющую способность при их адгезии на поверхности сперматозоидов [9, 14, 40], что приводит к снижению подвижности последних [19] и преждевременному индуцированию акросомной реакции [11]. Более того, бактериальная микрофлора может проявлять непрямое воздействие, продуцируя эндотоксины. Бактерии в приготовленных образцах спермы могут контаминировать среду, используемую в программах ЭКО для культивирования эмбрионов. Установлено, что Ureaplasma urealyticum повреждает нуклеарный хроматин в сперматозоидах человека и крысы. Несмотря на высокий процент оплодотворения ооцитов в культурах, инфицированных этим микроорганизмом, эмбрионы неспособны в них развиваться до стадии бластоцисты.


Возможность контролировать бактериальную контаминацию в обработанных образцах спермы без использования антибиотиков представляется очень важным с точки зрения защиты гамет от повреждения и предупреждения аллергических реакций у пациентов и медицинского персонала [27]. Не исключено, что такие антибиотики, как гентамицин, окситетрациклин, хлортетрациклин, неомицин, канамицин, нистатин, амфотерицин В, колимицин и хлорамфеникол, являются токсичными для спермы [35]. Хотя сочетание пенициллина и стрептомицина может быть использовано в средах для сперматозоидов, слебудут осаждаться во время центрифугирования, тогда как сперматозоиды с нарушенным хроматином, обладающие меньшей плотностью, будут задерживаться в верхнем слое или на границе раздела сред градиента. Подобным образом изопикническая точка для сперматозоидов с морфологическими дефектами головки будет находиться на другом уровне из-за их отличающейся плотности, на котором они и будут концентрироваться [32].

Основные различия качества образцов спермы после обработки методами swim-up и градиентного центрифугирования представлены в табл. 2. В отличие от swim-up в процессе градиентного центрифугирования удаляются аномальные сперматозоиды, посторонние клетки и бактерии. Сперматозоиды с дефектами морфологии бывают способны осуществлять оплодотворение, однако дальнейшее развитие таких эмбрионов и развитие беременности могут быть нарушены. В нескольких публикациях утверждается взаимосвязь морфологии сперматозоидов и процента оплодотворения. Заключают [32], что использование метода центрифугирования в градиенте плотности для приготовления образцов спермы помогает улучшить результативность программ ВРТ за счет повышения оплодотворяемости ооцитов.

Сперматозоиды с дефектами хроматина конкурируют с нормальными спермиями в процессе оплодотворения, поэтому во избежание получения эмбрионов низкого качества очень важно не допустить их попадание в суспензию, предназначенную для ЭКО [4]. Процент эмбрионов, прошедших дробление in vitro (Filatov et al., 1999), и процент достигнутых беременностей в ВРТ дует отметить, что дробление эмбрионов происходит быстрее при их отсутствии. Более того, пенициллин G разрушается в культуральной среде на 50% в течение 24 ч при 37° С [29]. Таким образом, предпочтительнее использовать такую технологию приготовления спермы для удаления бактериальной микрофлоры, которая позволяет избежать добавление антибиотиков в среду для отмывки сперматозоидов.

Способность градиента PureSperm удалять вирусы, такие как, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), имеет решающее значение для предложения ВРТ супружеским парам, в которых муж серопозитивен по ВИЧ. В некоторых странах, например в Швеции, не разрешено применение спермы мужчин, зараженных ВИЧ, в программах ВРТ. Однако было показано в нескольких клиниках, расположенных в разных странах, что вирусная контаминация снижается ниже уровня детекции при приготовлении сперматозоидов с помощью градиента PureSperm в сочетании с методом swim-up [15, 23, 24, 31].

Следует отметить, что по всему миру были рождены более чем 1000 детей в разных программах ВРТ с применением метода градиентного центрифугирования образцов спермы от инфицированных доноров [22]. Таким образом, использование сочетанного протокола градиентного разделения и swim-up является намного более безопасной альтернативой для зачатия ребенка у супружеских пар, в которых муж заражен ВИЧ, чем продолжение ведения половой жизни.

Результаты недавно проведенных исследований во Франции позволяют предполагать, что при использовании градиента PureSperm могутудаляться и другие патогенные вирусы, например, вирус гепатита С [7, 22, 31]. В то же время отделение всех вирусов от популяции сперматозоидов может быть невозможным, недавно сообщалось об идентифицировании с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса папилломы человека в сперматозоидах после обработки в градиенте Перколли [8]. Авторы заключают, что сперматозоиды могут служить в качестве векторов для определенных вирусов. Напротив, [5] докладывает, что источником вируса папилломы человека могли быть слущивающиеся с эрозий клетки канала уретры; такие клетки, а значит и вирусная контаминация, могут удаляться градиентом плотности PureSperm. Поэтому необходимы дополнительные исследования для ответа на вопрос, могут ли частицы этого вируса успешно удаляться при центрифугировании в градиенте.

Заключение

Использование центрифугирования в градиенте плотности (PureSperm) в качестве метода для обработки спермы представляет эффективную технологию для отбора нормальных, функционально активных сперматозоидов из эякулята. Применение градиента обеспечивает выделение сперматозоидов из эякулята, контаминированного различными патогенами, и делает возможным использование программ ВРТ для пациентов, зараженных инфекциями, передаваемыми половым путем. Эффективный отбор функционально активных сперматозоидов в процессе градиентного центрифугирования для осуществления оплодотворения приводит к улучшению результатов в программах ВРТ.

Дж.М. Моррелл, П.В. Холмз
Nidacon International AB, Швеция

Литература

1. Agarwal A., Ranganathan P. Higher rates of recovery with PureSperm density gradient compared to ISolate. Hum Reprod 2001; 16: P-053.

2. Aitken R.J., Clarkson J.S., Fishel S. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and sperm function. Biol Reprod 1989a; 41: 183.

3. Aitken R.J., Clarkson J.S., Hargreave T.B., Irvine D.S., Wu F.C.W. Analysis of the relationship between defective sperm function and the generation of reactive oxygen species in cases of oligospermia. J Androl 1989; 10: 214.

4. Ahmadi A., Ng S.-C. Fertilising ability of DNA-damaged sperm. J Exp Zool 1999; 284: 696-704.

5. Aynaud O., Poveda J.-D. Frequence of herpes simplex virus, cytomegalovirus and human papillomavirus DNA in semen. J Androl 2001; Suppl (Abstr): 1: 2-141.

6. Boulton V.N., Braude P.R. Preparation of human spermatozoa for in vitro fertilisation by isopycnic centrifugation of self-generating density gradients. Arch Androl 1984; 13: 176-176.

7. Cassuto N.G., Sifer C., Naouri M., Bouret D., Blanc-Layrac G., Benifla J.L., Neuraz A., Alvarez S., Madelenat P., Feldmann G., Devaux A. Screening of hepatitis C virus (HCV) in the different fractions of semen from infected infertile men. Hum Reprod 2001; 16: (Аbstr): 139.

8. Chan P.J., Su B.C., Kalugdan T., Seraj I.M., Tredway D.R., King A. Human papilloma virus gene sequences in washed human sperm deoxyribonucleic acid. Fertil Steril 1994; 61: 982-985.

9. Diemer T., Weidner W., Michelmann H.W. Influence of Escherichia coli on motility parameters of human spermatozoa in vitro. Int J Androl 1996; 19: 271-277.

10. Dozortsev D., Rybouchkin A., De Sutter P., Dhont M. Sperm Plasma membrane damage prior to intracytoplasmic sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. Hum Reprod 1995; 10: 2960-2964.

11. El-Mulla K.F., Kцhn F.M., Dandal M. In vitro effect of Escherichia coli on human sperm acrosome reaction. Arch Androl 1996; 37: 73-78.

12. Evenson D.P., Larson K.L., Jost L.K. The sperm chromatin structure assay (SCSA™): clinical use for detecting sperm DNA fragmentation related to male infertility and comparisons with other techniques. J Androl 2002; 23: (in press).

13. Feichtinger W., Obruca A., Brunner M. Sex chromosomal abnormalities and intracytoplasmic sperm injection. Lancet 1995; 346: 1566.

14. Friberg J., Fullan N. Attachment of Escherichia coli to human spermatozoa. Am J Obstet Gynecol 1983; 146: 465-467.

15. Fridstrцm M., Matilainen E., Hovatta O., Lindgren S., Bohlin A.-B., Pehrson P.O., Albert J. Is it possible to reduce the amount of HIV virus in semen. Proc. XIII Nordic IVF Congress. 2000; 34.

16. Guibert J., Merlet F., Le Dы A., Leruez M., Heard I., Costagliola D., Mandelbrot L., Kunstmann J.M., De Almeida M., Salmon D., Sicard D., Zorn J.R., Rouzioux C., Jouannet P. ICSI for HIV1 serodifferent couples: results of a preliminary study. Hum Reprod 2001; 16: (Abstr): 140.

17. Hlinka D., Herman M., Vesela J., Hredzak R., Horvath S., Pacin J. A modified method of intracytoplasmic sperm injection without the use of polyvinylpyrrolidone. Hum Reprod 1998; 13: 1922-1927.

18. Jean M., Miralliй S., Boudineau M., Tatin C., Barriиre P. Intracytoplasmic sperm injection with polyvinylpyrrolidone: a potential risk. Fertil Steril 2001; 76: 419-420.

19. Kaur M., Tripathi K.K., Bansal M.R. et al. Bacteriology of the cervix in cases of infertility: effect on human sperm. Am J Reprod Immunol Microbiol 1986; 12: 21-24.

20. Kuzan F.B., Hillier S.L., Zarutskie P.W. Comparison of three wash techniques for the removal of micro-organisms from semen. Obstet Gynecol 1987; 70: 836-839.

21. Levy R., Bourlet T., Garcia A., Cordonier H., Salle B., Lornage J., Pozzetto B., Guerin J.F. Assisted reproductive techniques (ART) in hepatitis C virus (HCV)-infected male patients: preliminary results. Hum Reprod 2001; 16: (Abstr): 141.

22. Lyerly A.D., Anderson J. Human immunodeficiency virus and assisted reproduction: reconsidering evidence, reframing ethics. Fertil Steril 2001; 75: 843-858.

23. Marina S., Marina F., Alcolea R., Nadal J., Exposito R., Huguet J. Pregnancy following intracytoplasmic sperm injection from an HIV-1-seropositive man. Hum Reprod 1998; 13: 3247-3249.

24. Marina F., Alcolea R., Exposito R., Martin P., Fosas N., Perez N., Marina S. Special semen-washing technique as a safe method for using assisted-reproduction techniques in HIV-1 seropositive men. Hum Reprod 1998; 15:(Abstr P-145): 155-156.

25. Meng-Yin Tsai, Fu-Jen Huang, Fu-Tsai Kung, Yi-Chi Lin, Shiuh-Young Chang, Jick-Fuu Wu, Hsueh-Wen Chang. Influence of Polyvinylpyrrolidone on the outcome of intracytoplasmic sperm injection. J Reprod Med 2000; 45: 115-120.

26. Morrell J.M., Sakkas D., Moffatt O., Manicardi G.C., Bizzaro D., Holmes P.V. Reduced senescence and retained chromatin integrity in human sperm prepared by density gradient centrifugation. J Androl 2001; Suppl (Abstr P5/6): 34.

27. Mortimer D. Practical Laboratory Andrology. Oxford University Press 1994.

28. Mortimer D. Sperm Preparation Methods. J Androl 2000; 21: 357-366.

29. Neftel K.A., Muller M.R., Walti M. Penicillin-G degradation products inhibit in vitro granulopoiesis. Br J Haematol 1983; 54: 255-260.

30. Nicholson C.M., Abramsson L., Holm S.E., Bjurulf E. Bacterial contamination and sperm recovery after semen preparation by density gradient centrifugation using silane-coated silica particles at different g forces. Hum Reprod 2000; 15: 662-666.

31. Pasquier C., Daudin M., Righi L., Berges L., Thauvin L., Berrebi A., Massip P., Puel J., Bujan L., Izopet J. Sperm washing and virus nucleic acid detection to reduce HIV and hepatitis C virus transmission in serodiscordant couples wishing to have children. AIDS 2000; 14: 2093-2099.

32. Prakash P., Leykin L., Chen Z., Toth T., Sergegh R., Schiff I., Isaacson K. Preparation by differential gradient centrifugation is better than swim-up in selecting sperm with normal morphology (strict criteria). Fertil Steril 1998; 69: 722-726.

33. Ranganathan P., Agarwal A. Recovery and survival of sperm is higher after preparation with PureSperm density gradients than with swim-up in cryopreserved-thawed semen specimens. Fertil Steril 2001; 76: Suppl P-311.

34. Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M., Mandrioli M., Bizzaro D., Bianchi P.C., Bianchi U. The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum Reprod 2000; 15: 1112-1116.

35. Salisbury G.W., VanDemark N.L., Lodge J.R. Physiology of Reproduction and Artificial Insemination in Cattle. 2 edn, W.H. Freeman. San Fransisco 1978.

36. Sцderlund B., Lundin K. The use of silane-coated silica particles for density gradient centrifugation in in-vitro fertilization. Hum Reprod 2000; 15: 857-860.

37. Strehler E., Baccetti B., Sterzik K., Capitani S., Collodel G., De Santo M. Detrimental effects of polyvinylpyrrolidone on the ultrastructure of spermatozoa (Notulae seminologicae 13). Hum Reprod 1998; 13: 120-123.

38. Tomlinson M.J., Moffat O., Manicardi G.C., Bizzaro D., Sakkas D. Sperm morphology and nuclear DNA integrity after density gradient centrifugation (DGC) through PureSperm: relationship to IVF outcome. J Androl 2001; Suppl (Abstr P3/4): 100.

39. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 1999; 4th edn. Cambridge University Press 1999.

40. Wolff H., Panhans A., Stolz W., Meurer M. Adherence of Escherichia coli to sperm: a mannose mediated phenomenon leading to agglutination of sperm and E. coli. Fertil Steril 1993; 60: 154-158.



- Доктор, у вас такая же болезнь, как у меня, но вы себя ни в чем не ограничиваете. Мне же ничего не разрешаете - ни пить, ни курить, ни переедать…
- Между нами большая разница.
- И какая же?
- Вы ведь хотите лечиться?
- Да.
- Ну, вот. А мне это и в голову не приходило.