Медицина в свете клеточной биологии

Какими бы впечатляющими не были успехи генетики, теперь уже ясно, что наследственная информация реализуется на уровне клетки. Постоянно появляются новые данные об адгезивных молекулах, цитокинах, ростовых факторах, путях сигнальной трансдукции, роли внеклеточного матрикса, ионных каналах и рецепторах. Успехи клеточной биологии и смежных дисциплин создали надежный фундамент для разработки новых подходов в лечении различных заболеваний.

Возвращение к Вирхову

О том, что первой и важнейшей структурной единицей жизни является клетка, представляющая собой самую общую и самую постоянную форму живой материи, впервые заявил Р.Вирхов. Он с особой настойчивостью повторял, что клетка построена по принципу "постоянно повторяющегося устройства", не подлежащего дальнейшему разложению на части, поскольку только в клетке молекулы могут приобрести ту, строго определенную, структурную взаимосвязь, которая обеспечивает возникновение всех "феноменов жизни" и в первую очередь репродукции ("omnius cellula e cellula" - всякая клетка из клетки).

"Клетка, - указывал Р.Вирхов, - ...есть последний морфологический элемент всех живых тел... Мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне ее... Каждое животное является суммой жизненных единиц, из которых всякая отдельно взятая содержит все необходимое для жизни".

Опираясь на эти универсальные, с его точки зрения, принципы организации живой материи, Р.Вирхов прямо заявил, что материальным субстратом и одновременно единственно возможным "местом" болезни в организме человека является клетка, а болезнь есть не что иное, как сумма поражения множества отдельных клеток. Установленная и полностью обоснованная Р.Вирховом необходимость тщательного всестороннего анализа патоморфологических изменений на клеточном уровне очень скоро получила всеобщее признание, позволив добиться значительных успехов в изучении заболеваний, совершенствовании их диагностики и лечения. Что же касается теории целлюлярной патологии Р.Вирхова как комплексной системы теоретических положений, то с момента своего появления она встретила и одобрение, и возражения, вплоть до полного отрицания.

Открытие внутриклеточных органелл, построенных по принципу "постоянно повторяющегося устройства" и обладающих "всеми признаками жизни", неклеточных форм жизни (вирусы), а главное феноменальные успехи генетики, энзимологии, биохимии и гистохимии, молекулярной биологии не только создали необходимую почву для появления нового направления в медицине - молекулярной патологии, но и, казалось бы, навсегда поставили крест на целлюлярной патологии.

Однако с течением времени становится все более очевидным, что целлюлярную патологию слишком рано списали в анналы истории. Первыми ушли в небытие спекуляции на тему о спонтанном образовании живых структур из неживого вещества. Недавняя расшифровка генома человека уточнила наследуемую программу развития организма из одной клетки-зиготы в сложно организованную многоклеточную систему. Стало ясно, что геном - это целостная система наследственной информации организма. Если бы геном был не только целостной, но и самостоятельной единицей, вся совокупность клеточных ингредиентов могла бы создаваться полностью de novo, при условии целостности генома и наличия биосинтетического аппарата. Однако ни ядро, ни органеллы как эндоплазматический ретикулум (аппарат Гольджи), ни плазматические мембраны или лизосомы не могут быть созданы абсолютно заново без наличия хотя бы фрагментов данных структур. Эти органеллы перед клеточным делением распадаются на фрагменты и затем собираются из них заново. Можно предположить, что предшествующие фрагменты играют роль матриц, которые определяют корректность сборки. Геном не в состоянии из отдельных молекул воссоздать эти матрицы, появившиеся в какой-то момент эволюции и получившие от него автономность. Такая функция под силу только клетке.

Каждый живой организм, будь он одноклеточный или многоклеточный, сообразует свою жизнедеятельность с двумя принципиальными обстоятельствами - взаимоотношением с окружающей средой и своей адекватностью этой среде, а также своим внутренним состоянием. Чтобы принимать решения о реакциях в ответ на изменения этих обстоятельств, организм использует сложные системы сигнализации. А вся совокупность сигнальных систем клеток многоклеточного организма образует единый информационный комплекс, позволяющий клетке вырабатывать поведение, соответствующее потребностям организма. Исходя из современных представлений о роли и месте клеток в живом организме, подходы к созданию и развитию клеточных технологий лечения больных должны учитывать множество разных факторов. Вместе с тем в последние годы сложились отчетливые представления о наиболее перспективных клеточных технологиях, использующих современные достижения клеточной биологии (первичные клеточные культуры, клеточная инженерия, тканевая инженерия).

Первичные клеточные культуры

Успехи в области клеточной и молекулярной биологии привели к значительному прогрессу в технологии клеточных культур. Использование систем in vitro стало не только основополагающим подходом для изучения механизмов функционирования клеток, но и ведущим инструментом для управления клеточными процессами, в частности для активного контроля пролиферации и дифференцировки. Первичные клеточные культуры наиболее полно отражают структурный и функциональный потенциал тех тканей, из которых они были выделены. С одной стороны, этот метод служит прекрасным инструментом для изучения фундаментальных основ межклеточных взаимодействий в исследуемом органе, с другой - первичные культуры позволяют наиболее эффективно проводить первичный скрининг разрабатываемых лекарственных средств на стадии доклинических испытаний.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придании им in vitro с помощью генетических конструкций или сигнальных молекул специфических свойств и введении их в организм больного. Наиболее ярким примером клеточной инженерии является использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса.

Хотя дендритные клетки были описаны в середине XIX века как антигенпредставляющие клетки, объектом пристального изучения они стали только в 70-е годы XX века, когда было показано, что лимфоидные дендритные клетки являются сильными стимуляторами первичного иммунного ответа. Во-первых, они отличаются от других антигенпредставляющих клеток (В-лимфоциты, моноциты и макрофаги) тем, что их стимулирующий эффект на Т-лимфоциты в 10-100 раз сильнее. Во-вторых, они являются единственными антигенпредставляющими клетками, которые способны представлять наивным Т-клеткам неизвестные антигены и усиливать иммунный ответ.

Идет процесс накопления знаний о самих дендритных клетках (их получение, культивирование и активация), антигенах (их источники, приготовление и доставка) и об управлении дендритными клетками в организме реципиента (дозы, частота и пути введения). Кроме того, разрабатываются критерии оценки адекватности ответа иммунной системы на введение модифицированных дендритных клеток.

Дендритные клетки представляют собой и векторы, и мишени для изменения иммунного статуса организма. Они обладают уникальной способностью представлять антигены Т-лимфоцитам и таким образом участвуют в определении направленности иммунных реакций. В связи с этими свойствами возлагается много надежд на возможное их использование в модуляции иммунного ответа при опухолях, инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. Клинические испытания клеточных вакцин на основе дендритных клеток, несмотря на обнадеживающие результаты при лечении опухолевых заболеваний, еще находятся в начальной фазе.

Основными этапами создания клеточных вакцин для лечения инфекционных заболеваний являются следующие:

изучение механизмов, с помощью которых микроорганизмы модулируют экспрессию генов и функции дендритных клеток;
определение рецепторов дендритных клеток и сигнальных путей, через которые действуют микробные стимулы;
создание медиаторов, активирующих дендритные клетки в определенном направлении для стимуляции необходимого иммунного ответа;
выбор дизайна векторов, продуцирующих данные медиаторы и стимулирующих дендритные клетки in vivo.

Такая стратегия исследований по использованию дендритных клеток может привести к созданию новых лекарств и вакцин, которые позволят стимулировать иммунитет против различных инфекций и злокачественных новообразований или тормозить его при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации органов и тканей. Возможности клеточной инженерии существенно расширяются в комбинации с генной инженерией. В выделенные от пациента клетки и размноженные in vitro фибробласты, лимфоциты, стволовые клетки и т.д. вводят соответствующий ген. Клетки тестируют и вводят пациенту (ex vivo).

Более 40% клинических испытаний способов генной терапии (свыше 450) проводится с использованием клеточных технологий. Из них в 40% случаев в качестве носителей гена используют стволовые гемопоэтические клетки. Популярность стволовых клеток связана с их способностью к самоподдержанию, что уменьшает риск элиминации введенного гена. Стволовые кроветворные клетки, несмотря на их малочисленность, легко выделяются из периферической крови и костного мозга взрослых и из пуповинной крови новорожденных, идентифицируются и достаточно хорошо сохраняются при лабораторных манипуляциях. Кроме того, они способны к дифференцировке в различные клетки крови и иммунной системы, а также в клетки других тканей.

Надежды исследователей связаны с возможностью использования для генной терапии других соматических стволовых клеток, в частности миобластов. Они легко встраиваются в мышечные фибриллы, становясь составной частью мышечной ткани. Поскольку генетически модифицированные миобласты в мышечной ткани взаимодействуют с нервами и сосудами, их можно использовать для лечения не только мышечных, но и нейродегенеративных и эндокринных заболеваний, а также гемофилии и ряда опухолей.

Тканевая инженерия

Тканевая инженерия является самостоятельным междисциплинарным направлением. При этом для замещения пораженных органов и тканей используют принципы биологии и инженерии, с помощью которых восстанавливают, поддерживают или улучшают функции органов и тканей. Тканевая инженерия отличается от стандартной терапии тем, что сформированная инженерным путем ткань интегрируется в организм пациента, осуществляя постоянное и специфическое лечение болезни. При создании новой ткани используют один из трех общих подходов.

Дизайн и выращивание ткани человека in vitro с последующей ее имплантацией для восстановления или замещения поврежденных тканей. Наиболее ярким примером подобной терапии является пересадка компонентов кожи при лечении ожогов, использующаяся в клинике более 10 лет.
Имплантация клеток с индукторами репарации или регенерации поврежденных тканей. Этот подход основан на выделении клеток, добавлении к ним определенных сигнальных молекул и переносе этих клеток в биоматериалы, обеспечивающие регенерацию тканей. Чаще всего в качестве биоматериалов используют полимеры, образующие трехмерные конструкции, удобные для прикрепления и роста клеток, реконструирующих поврежденные ткани. Примером такого биоматериала может служить биоматрикс, стимулирующий рост костной ткани при заболеваниях периодонта.
Мобилизация собственного потенциала тканей для восстановления функции поврежденных органов и тканей. При этом используют технику выделения стволовых клеток, которые имплантируют пациенту либо непосредственно в суспензии или в структурном матриксе, либо после их коммитирования in vitro.

Возможность гистотипического восстановления поврежденных тканей и органов представляет значительный интерес. Современные методы изоляции клеток и подходы к их культивированию предполагают использование как специализированных зрелых клеток, так и их предшественников на любых этапах дифференцировки. Многообещающие перспективы развития тканевой инженерии связаны с возможностью использования в качестве исходного материала не только ксено- и аллогенных источников, но и аутогенных клеток, размноженных вне организма и ретрансплантированных в составе реконструированной ткани. Такой подход в самом ближайшем будущем может стать реальной альтернативой классической трансплантологии.

Первым органом, который попытались воссоздать ex vivo, стала кожа человека. Все исследования, проводимые на клеточной модели кожи, имеют большое значение в таких областях медицины, как фармакология (при доклинических испытаниях лекарственных средств), косметология (при испытаниях косметических средств), токсикология, дерматология (при инфекционно-аллергических заболеваниях кожи), хирургия и травматология (при заживлении ран и пересадке кожи).

Эмбриональные стволовые клетки

Значительные перспективы для восстановления функции пораженных органов и тканей сулит техника, связанная с использованием стволовых клеток. Известно несколько видов стволовых клеток: эмбриональная стволовая клетка (из бластоцисты); стволовая клетка эмбриональных тканей; стволовая клетка дифференцированных тканей (соматическая стволовая клетка). Все стволовые клетки, независимо от происхождения и источника выделения, обладают тремя общими уникальными свойствами - способны к самоподдержанию в течение длительного времени; не специализированы, то есть не имеют каких-либо тканеспецифических маркеров, ответственных за выполнение специальных функций; способны к дифференцировке в любые специализированные клетки.

История их изучения берет начало с концепции стволовой клетки, предложенной русским гистологом А.Максимовым в 1908 г. применительно к кроветворной ткани. Середина 70-х годов ХХ века ознаменовалась крупным успехом в изучении клеточного состава костного мозга и открытии в его строме мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток группой отечественных ученых во главе с А.Фриденштейном. В конце 90-х годов значительные успехи были достигнуты в изучении эмбриональных стволовых клеток.

После выделения плюрипотентных линий из предимплантационных эмбрионов опубликован огромный материал, касающийся биологии эмбриональных стволовых клеток и результатов направленной дифференцировки в специализированные клеточные типы. В опытах на линиях мышиных эмбриональных стволовых клеток получены кардиомиоциты, кроветворные клетки-предшественники, клетки желточного мешка, скелетные миоциты, гладкомышечные клетки, адипоциты, хондроциты, эндотелиальные клетки, меланоциты, нейроны, глия, островковые клетки поджелудочной железы, примитивная энтодерма.

Отличительными особенностями эмбриональных стволовых клеток являются их способность к бесконечной пролиферации симметричным делением в лабораторной культуре и выраженная клоногенность, то есть способность к образованию из одной первоначальной стволовой клетки целой линии генетически идентичных ей. В то же время огромный интерес представляют открытые недавно свойства пластичности стволовых кроветворных клеток и соматических стволовых клеток. Они дифференцируются в ограниченное число клеточных типов, то есть имеют потенциал мульти- или унипотентного созревания и не обладают плюрипотентностью - способностью давать начало всем клеточным типам, образующимся из трех зародышевых листков.

Исследования последних лет продемонстрировали не только возможность выделения соматических стволовых клеток человека, но и их направленную дифференцировку in vitro и in vivo.

Подавляющее большинство публикаций последнего времени посвящено эмбриональным стволовым клеткам как наиболее многообещающим для развития клеточных технологий. Выработан ряд критериев использования эмбриональных стволовых клеток в клинической практике: выделение эмбриональных стволовых клеток и получение их культур с направленной дифференцировкой; проведение теста на физиологическую функциональность эмбриональных стволовых клеток в культуре; проведение теста на функциональную эффективность на моделях; проведение теста на безопасность на животных; тестирование полученных клеток на возможность развития реакции отторжения.

До сегодняшнего дня имеются лишь отдельные достоверные сообщения об успешном применении эмбриональных стволовых клеток в эксперименте и клинике. Есть и серьезные аргументы против использования эмбриональных стволовых клеток в лечении заболеваний:

иммунологическая несовместимость клеток, пересаживаемых реципиенту;
неполное соответствие условий клеточной дифференцировки in vivo и in vitro;
невозможность обнаружения генетических дефектов до пересадки эмбриональных стволовых клеток;
отсутствие доказательств эффективности и безопасности применения эмбриональных стволовых клеток;
этические проблемы.

Несмотря на тщательный подбор донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости, а также на успехи иммуносупрессивной терапии, вероятность иммунологического отторжения крайне велика. Пересадка эмбриональных стволовых клеток, подобно трансплантации органов, не излечивает больного, а продлевает его жизнь. Генноинженерные манипуляции, способные изменить иммунные характеристики эмбриональных стволовых клеток и снизить риск развития реакции "трансплантат против хозяина", не могут обеспечить полную безопасность пациенту. Риск появления генетических мутаций при генно-инженерных манипуляциях вполне реален. Не исключено, что эти мутации будет сложно обнаружить до трансплантации.

Предлагаемое в качестве альтернативы так называемое терапевтическое клонирование, когда генетическая информация стволовой клетки замещается генетической информацией от пациента, достаточно опасно, так как в таких "терапевтических" клонах велика вероятность возникновения аномалий, делающих невозможным их использование в лечении.

Для корректной дифференцировки эмбриональных клеток необходимы многочисленные факторы, например механическое натяжение, разнообразие электрических полей, комплекс структурного микроокружения, способствующих упорядоченной активации и экспрессии генов. Полное воспроизведение этих немолекулярных компонентов эмбрионального развития пока нереально. Трансплантация пациенту некорректно дифференцированных клеток представляет серьезный риск, связанный с высоким туморогенным потенциалом эмбриональных стволовых клеток.

До настоящего времени не доказано, что клетки, образованные из эмбриональных стволовых клеток, можно безопасно трансплантировать взрослому животному для восстановления функции поврежденной ткани или органа. Ситуация, сложившаяся к сегодняшнему дню с эмбриональными стволовыми клетками, напоминает эксперименты с генной терапией - большие надежды, большие проблемы и пока невысокий эффект.

Соматические стволовые клетки

Необходимость преодоления серьезных ограничений по использованию эмбриональных стволовых клеток была бы очевидной в отсутствие видимой альтернативы. Однако в последние годы наметился значительный прогресс в области исследований соматических стволовых клеток. Преимущества их использования вместо эмбриональных очевидны: соматические стволовые клетки получают из тканей самого пациента, поэтому проблемы иммунологического отторжения не существует. Стволовые клетки из дифференцированных тканей не вызывают образования тератом, а терапевтическое использование соматических стволовых клеток самого пациента не создает этических проблем.

В последние десятилетия были разработаны различные методы выделения и обогащения кроветворных стволовых клеток из периферической крови, костного мозга и пуповинной крови, являющейся наиболее перспективным источником получения кроветворных стволовых клеток. В России вслед за странами Западной Европы и США создаются банки кроветворных стволовых клеток, в которых последние не только находятся на хранении, но и могут использоваться для аллогенных трансплантаций и генной терапии. За последние пять лет опубликованы сотни сообщений о применении соматических стволовых клеток (в первую очередь кроветворных стволовых клеток) в эксперименте и клинике.

Существует ряд проблем, связанных с использованием соматических стволовых клеток:

соматические стволовые клетки, в отличие от эмбриональных стволовых клеток, плохо растут в культуре и ограничены к дифференцировке в любые другие клеточные типы;
несмотря на многочисленные публикации, пока не ясно, как долго можно поддерживать и коммитировать соматические стволовые клетки из дифференцированных тканей в зрелые клетки любых других тканей;
использование стволовых клеток в регенераторной медицине сопряжено с проблемой их идентификации, поскольку не существует надежных маркеров, позволяющих достоверно определять соматические стволовые клетки в различных тканях.

В связи с этим эмбриональные стволовые клетки кажутся более привлекательными, поскольку доказана их способность (в эмбриональном микроокружении) генерировать все клеточные типы. На практике, однако, чрезвычайно трудно получить в культуре из эмбриональных стволовых клеток тот тип клеток, который планируется. Одним из вариантов решения этой проблемы является получение стволовых клеток из пуповинной крови новорожденных и их хранение в банках стволовых клеток.

Заключение

Перечень примеров, наглядно демонстрирующих реальное значение клеточной биологии в решении актуальных проблем медицины XXI века, может быть продолжен. Вместе с тем уже сейчас становится очевидным, что дальнейший прогресс как самой клеточной биологии, так и медицинской науки в целом будет связан не только и не столько с дальнейшим накоплением фактического знания, сколько с его творческим осмыслением. Основная историческая заслуга Р.Вирхова состояла не в числе совершенных им конкретных открытий, а в создании научно достоверной теоретической концепции, определившей естествоиспытателям основное направление поиска и тем самым сыгравшей решающую роль в развитии медицины конца XIX - первой половины XX века. Сегодня аналитическая работа ученых явно превалирует над синтезом и осмыслением полученных данных, а потому необходимость теоретической концепции, подобной той, что в середине XIX века предложил Р.Вирхов, необходима, как никогда. Эта концепции должна быть построена на фундаменте нового знания и способна определить как направление, так и содержание дальнейшего развития современной патологии.

Открытие стволовой клетки и развитие связанных с этим открытием клеточных технологий в медицине наряду с расшифровкой двойной спирали ДНК и генома, безусловно, относятся к важнейшим событиям, произошедшим в биологии в ХХ веке. Именно клеточные технологии являются основой генной терапии, с которой связаны надежды на разработку индивидуальных схем лечения пациентов с самыми тяжелыми заболеваниями, в том числе наследственными. Клеточные технологии и генная терапия представляют собой наиболее универсальные современные подходы к лечению. Медицина ХХI века, безусловно, будет основана на фундаментальных достижениях клеточной биологии.

Михаил ПАЛЬЦЕВ,

академик РАН и РАМН,

ректор Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

НА СНИМКЕ: М. Пальцев.