Лабораторная диагностика сифилиса

Значительное распространение сифилитической инфекции, патоморфоз заболевания, отсутствие надежных противоэпидемических мероприятий предопределили чрезвычайную актуальность лабораторной диагностики сифилиса.

При заразных формах сифилиса особое значение имеет выявление возбудителя. Бледная трепонема получила свое название благодаря слабой способности воспринимать окраску. Возбудитель сифилиса имеет спиралевидную форму, от 4 мкм до 14 мкм в длину и 0,2-0,25 мкм в поперечнике. Число оборотов спирали - 8-12, завитки ее равномерны, кверху закруглены, расстояния между ними одинаковые, высота завитков по направлению к концам уменьшается. Во время движения число завитков и их толщина могут меняться. Бледная трепонема обладает вращательным, поступательным, волнообразным, сгибательным движением. Наряду со спиралевидной      формой доказана возможность существования трепонемы в виде зерен, цист, шарообразных, веревкообразных образований и т.п.

Для исследования на бледную трепонему необходима тканевая жидкость, так как трепонемы располагаются в тканевых щелях, вокруг лимфатических и кровеносных сосудов, между волокнами соединительной ткани, в стенках и просветах лимфатических капилляров. Исследованию на бледную трепонему подлежат все сыпные элементы, подозрительные на первичный и вторичный сифилис (эрозивные и язвенные шанкры, мокнущие и эрозивные папулы, кондиломатозные образования, трещины и эрозии слизистых оболочек рта и половых органов).

С целью получения материала для исследования на бледную трепонему чаще пользуются методом раздражения сыпного элемента, если он имеет склонность к мацерации. При этом необходимо предварительно освободить поверхность язвочки, эрозии или папулы от корочек, возможного загрязнения применявшимися пациентом наружными средствами. Чтобы не вызвать излишнее кровотечение, делать это следует осторожно, пользуясь стерильными ватно-марлевыми тампонами, смоченными изотоническим раствором хлорида натрия. Очищенную поверхность, подлежащую исследованию, просушивают тампоном и при помощи платиновой лопаточки или вольфрамовой петли осторожно массируют у края до тех пор, пока не появится тканевая, слегка опалесцирующая жидкость, из которой готовят материал для исследования. Из немацерированных высыпных элементов материал для исследования на бледную трепонему получают методом скарификации при помощи скальпеля. Этот способ применяется нечасто, так как значительная примесь крови к тканевой жидкости затрудняет нахождение в препарате бледных трепонем.

Если провести исследование на бледную трепонему непосредственно с поверхности шанкра невозможно (заэпителизировавшийся элемент, отсутствие эрозии или язвы), при наличии подозрительного на сифилитический пахового склераденита с целью получения материала может быть рекомендована пункция лимфатического узла. Для этого пользуются шприцем с плотно пригнанным поршнем и иглой со слегка затупленным концом. Место прокола обрабатывают спиртом и 3-проц. раствором йода. Лимфатический узел фиксируют между 1-м и 2-м пальцами левой руки. Правой рукой иглу вкалывают параллельно продольной оси лимфатического узла, не вынимая иглу, левой рукой слегка массируют лимфатический узел, затем иглу очень медленно извлекают из лимфатического узла, производя аспирирующие движения поршнем шприца. При этом в просвете иглы окажется материал, необходимый для исследования на бледную трепонему.

Материал, полученный одним из упомянутых способов, можно исследовать в нативном препарате (в темном поле зрения) или в виде окрашенных препаратов. Исследование нативного материала в темном поле предпочтительнее, так как позволяет ориентироваться не только на морфологию бледной трепонемы, но и на ее характерные движения.

Препараты для исследования в темном поле зрения необходимо готовить на тонких, хорошо обезжиренных стеклах. Если материала для исследования мало, например при пункции лимфатического узла, его смешивают с одной каплей изотонического раствора хлорида натрия. Каплю накрывают покровным стеклом. Микроскопическое исследование препарата производят при помощи темнопольного специального конденсора при объективе х40 и окуляре х10 или х15. При исследовании в темном поле нативного препарата из тканевой жидкости можно видеть большое количество мелких твердых частиц, находящихся в броуновским движении, некоторое количество форменных элементов крови -  эритроцитов (элементы правильной округлой формы, окруженные светящимся ободком), лимфоцитов (элементы округлой формы, сероватые, тускло светящиеся), эпителиальных клеток (значительно крупнее лейкоцитов, неправильной округлой формы, обладают ярким свечением), нейтрофилов (ярко светящиеся зернистые образования).

Следует учитывать, что бледная трепонема недостаточно сильно преломляет свет и поэтому имеет вид тонкой пунктирной спирали, так как всегда лучше освещаются выпуклые стороны ее завитков. Для бледной трепонемы характерно, что она сгибается и делает при этом поступательные движения, скорость которых то увеличивается, то замедляется.

Бледную трепонему необходимо дифференцировать от T. refringens, которая встречается на гениталиях. Морфологическое различие их заключается в том, что T. refringens часто имеет всего 5-7 грубых завитков. Она короткая, толстая, характеризуется беспорядочными движениями, имеет более яркое, со слегка золотистым оттенком, свечение в отличие от серебристого свечения бледных трепонем.

Бледная трепонема отличается от зубной (в зубном налете) большим  числом завитков и более пологой их формой.

Иногда нити фибрина могут напоминать бледные трепонемы, но отличаются тем, что имеют вид длинных, с крупными завитками образований, тонких, неравномерных по толщине.

Исследование в темном поле зрения является основным методом обнаружения бледных трепонем. В исключительных случаях, когда по каким-либо причинам исследование в темном поле зрения невозможно, допускается окрашивание по Романовскому - Гимзе. Каплю тканевой жидкости помещают на предметное стекло и готовят из нее мазок, который высушивают при комнатной температуре. Фиксация мазка осуществляется в смеси Никифорова (этиловый спирт и эфир в равных объемах). После испарения с мазка фиксирующей жидкости производят окраску препарата краской Романовского - Гимзы, разведенной из расчета 2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. Для этого 10-15 мл разведенной краски наливают в чашку Петри, на две стеклянные палочки мазком вниз опускают предметное стекло и оставляют препарат для окрашивания на 2-5 часов, в зависимости от интенсивности окрашивающей способности раствора. После окончания окрашивания предметное стекло с мазком осторожно промывают боковой струей воды. Высушивание препаратов происходит при комнатной температуре. Микроскопическое исследование проводят в иммерсионной системе. При окраске препаратов по методу Романовского - Гимзы бледная трепонема приобретает розовый или розовато-фиолетовый цвет, в то время как другие трепонемы окрашиваются в интенсивно синеватые тона.

В последнее время при изучении материала из полости рта или в тех случаях, когда невозможно непосредственное темнопольное изучение материала, используется и прямая реакция иммунофлюоресценции (РИФ-Тр). Это исследование обнаруживает и дифференцирует патологические спирохеты от непатологических при помощи реакции антиген - антитело. Как и в методике микроскопирования, в темном поле негативный результат вовсе не исключает наличие сифилиса, потому что на способности метода демонстрировать патологические виды бледной трепонемы могут влиять состояние дефекта клинического материала, возможные технические факторы. В то же время чувствительность метода РИФ-Тр может достигать 100% и позволяет поставить диагноз "сифилис" при первичном, вторичном, раннем врожденном или рецидивном сифилисе даже без учета результатов серологических тестов.

При изготовлении флюоресцирующих иммуноглобулинов в качестве исходного компонента используют глобулиновую фракцию, желательно с максимальным содержанием IgG. При методе выделения иммуноглобулинов осаждением каприловой кислотой содержание IgG в белковой фракции достигает 90%, содержание альбуминов в ней незначительно, для метки расходуется минимальный объем  флюорохрома.

В качестве сырья для получения IgG используют гипериммунную трепонемную кроличью сыворотку. На 1 г белка добавляют 20 + 1 мг флюоресцеинизотиацианата (ФИТЦ). Конъюгацию осуществляют при температуре 20-22 С при контакте белка с флюорохромом в течение 2 часов при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Величина рН реакционной смеси составляет 9,5 + 0,1.

Очистку конъюгатов от несвязавшегося красителя осуществляли гельфильтрацией на колонках с сефадексом марки G-50 и G-100 с последующим элюированием конъюгата 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 9,5 + 0,1. Далее конъюгацию белка определяют спектрофотометрически и вычисляют концентрацию белка.

Специфическую активность препаратов проверяют на нативных штаммах трепонем. Для определения чувствительности флюоресцирующих конъюгатов используют гомологичные штаммы в разных концентрациях. Специфичность исследуется на взвесях гетерологических штаммов патогенных и сапрофитных дептоспир.

 В серологической диагностике сифилиса используются нетрепонемные и трепонемные тесты. Нетрепонемные тесты позволяют  обнаружить в исследуемой сыворотке антитела к кардиолипин-лецитиновому антигену (получаемому из сердца быка),   который является  одним из компонентов тканей человеческого организма и содержит липиды, характерные для бледной трепонемы.

 В нашей стране в качестве отборочных нетрепонемных тестов согласно приказу Минздрава СССР № 1161 от 02.09.85 "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса" и приказу Минздрава Российской Федерации № 87 от 26.03.01 "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса" применяется комплекс серологических реакций, включающий микрореакцию преципитации с плазмой и инактивированной сывороткой и реакцию связывания комплемента с трепонемным и кардиолипиновым антигенами РСК.

Нетрепонемные (реагиновые) тесты определяют антитела класса IgG и IgM к липоидному материалу, высвобождаемому из поврежденных клеток хозяина, так же, как и к липопротеиноподобному материалу и, вероятно, к трепонемному кардиолипину. Антилипидные антитела могут появляться не только вследствие сифилиса или других трепонемных инфекций, но и в ответ на развитие нетрепонемных заболеваний как острой, так и хронической природы, при которых наблюдается разрушение тканей. Для подтверждения диагноза необходимы дополнительные исследования.

 В основе всех видов микрореакций лежит стандартный кардиолипин-лецитин - холестероловый антиген. Специфичность зависит от наличия ложноположительных результатов в исследуемой популяции. Существует две основные разновидности микрореакций.

1. Микроскопическая оценка при помощи обычного светового микроскопа, оборудованного окуляром х10 и объективом х10. В микроскопических тестах липосомы, формирующиеся в кардиолипин-холестерол-лецитиновой эмульсии, еле заметны. В реакциях флоккуляции, преципитации и агглютинации вначале происходит распознавание антителом антигена, за которым следуют агрегация и образование комплекса антиген - антитело. К такому типу реакций относится VDRL (Venereal Disease Research laboratory) - реакция с инактивированной сывороткой крови. Результаты теста оцениваются как реактивные (в случае образования крупных агрегатов в виде коротких стержневидных структур), слабореактивные (если образования незначительны) и нереактивные (если не наблюдается какой-либо флоккуляции). Реактивные или слабореактивные результаты указывают на наличие активной инфекции, но не могут полностью ее исключить в инкубационный период. При подозрении на нейросифилис при помощи VDRL исследуют спинномозговую жидкость.
2. Макроскопическая оценка (невооруженным глазом): тест быстрых плазменных реагинов на 18 мм круге пластины (Rapid Plasma Reagins, RPR), его автоматизированная модификация - автоматизированный реагиновый тест (Automated reagin test, AR), тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test, TRUST), использующие антиген USR, в который добавлен визуализирующий агент. В RPR-тесте в этом качестве используют частички угля, в TRUST-тесте - частицы азокрасителя толуидинового красного. Эти агенты вовлекаются в комплекс антиген - антитело, образующийся при исследовании реактивной пробы. Результаты оценивают согласно размерам образовавшихся конгломератов как реактивные или нереактивные. Все пробы, демонстрирующие в этом тесте любую степень реактивности, должны быть оценены количественно. Недостаточная чувствительность и специфичность не позволяют рекомендовать эти тесты для исследования спинномозговой жидкости.

 При проведении классической реакции связывания комплемента - реакции Вассермана в настоящее время используют ультразвуковой дезинтеграт культуральных трепонем. Реакция основана на феномене связывания комплемента комплексом, образуемым антигеном и антителом, содержащимся в исследуемой сыворотке крови, который сорбирует вводимый в реакции комплемент. Индикация образовавшегося комплекса достигается введением гемолитической    системы - второго возможного комплекса, где в качестве антигена присутствуют эритроциты барана, а в качестве компонента, содержащего антитела, - гемолитическая сыворотка кролика, предварительно иммунизированного эритроцитами барана. При наличии в испытуемой сыворотке крови реагинов или антитрепонемных антител антигены, вводимые в реакцию, образуют комплекс, который полностью или частично, в зависимости от количественного содержания антител, свяжет имеющийся комплемент. При этом добавленные во второй фазе реакции эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика из-за отсутствия свободного комплемента комплекс образовать не смогут, что проявится полным или частичным отсутствием гемолиза. Если в испытуемой сыворотке крови нет реагинов или антитрепонемных антител, определяется комплемент, оставшийся полностью. Несвязанный комплемент будет во второй фазе реакции связан комплексом, состоящим из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика, что проявится наступлением гемолиза.

Для проведения исследования требуется 4-5 мл крови, которую можно получить пункцией локтевой вены или другим доступным способом. Перед взятием крови необходимо исключить прием пациентом алкоголя и наркотических средств. Кровь для исследования не рекомендуется брать ранее 5-6 часов после последнего приема пищи. Проросшие, хилезные и гемолизированные сыворотки для исследования в реакции Вассермана непригодны. До исследования сыворотку крови инактивируют в течение 30 минут в водяном или суховоздушном инактиваторе при температуре 56 С с целью разрушения присутствующего в ней комплемента и стабилизации белковых фракций. После этого регистрируют результаты реакции Вассермана. Полное отсутствие гемолиза оценивается 4+ (резко положительные результаты реакции Вассермана), едва начавшийся гемолиз - 3+ (положительные результаты реакции Вассермана), гемолиз значительный - 2+, незначительная мутность содержимого пробирки - 1+ или + (слабоположительные или сомнительные результаты реакции Вассермана). Полный гемолиз считается отрицательным результатом.

Реакции связывания комплемента можно использовать для исследования неинактивируемой спинномозговой жидкости, при этом для повышения чувствительности рекомендуются методики постановки на холоде. К ним относится реакция Колмера. Особенностью этой реакции является двухфазность температурных режимов, при которых она протекает, и, как следствие, ее более выраженная чувствительность и способность улавливать антитела в тех сыворотках крови, где в силу их небольшого содержания результаты реакции Вассермана остаются отрицательными. Обработку испытуемой сыворотки крови и приготовление разведения антигенов производят по той методике, что и для постановки реакции Вассермана. Вместо изотонического раствора хлорида натрия в реакции Колмера используется солевой раствор следующей прописи: в 1 л дистиллированной воды растворяют 0,85 г химически чистого хлорида натрия и 0,12 г химически чистого сульфата магния. Солевой раствор хранению не подлежит, используется однократно. Для индикации результатов реакции Колмера используют раздельно 2-проц. взвесь эритроцитов барана в солевом растворе и гемолизин, разведенный по удвоенному титру. Гемолитическая сыворотка консервируется нейтральным глицерином в соотношении 1:1.

Результаты количественных тестов используются для контроля излеченности.

 Антитела, определяемые нетрепонемными тестами, обнаруживаются не ранее чем через  неделю после образования шанкра, обычно через 3-4 недели после возникновения первичного аффекта (1-2 месяца после инфицирования).

Нетрепонемные тесты относительно доступны и просты в исполнении, чувствительность их составляет не менее 93-94%. Хорошо известны случаи ложноположительных реакций, чаще всего они связаны с гепатитами, инфекционным мононуклеозом, вирусной пневмонией, ветряной оспой, корью, другими вирусными инфекциями, беременностью, эндокринными, онкологическими заболеваниями, наркотической зависимостью.

Для дифференцирования биологически ложноположительных реакций используются трепонемные тесты, в частности реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Она входит в состав рекомендованных приказом Минздрава СССР № 1161 от 02.09.85 серологических реакций на сифилис. В основе этой реакции лежит феномен обездвиживания бледных трепонем антителами сифилитической сыворотки (иммобилизины) в присутствии активного комплемента морской свинки. Сыворотки крови обследованных с ложноположительными результатами стандартных серологических реакций не вызывают феномен иммобилизации бледных трепонем вследствие того, что содержат только реагины и не включают специфические антитрепонемные антитела. Кровь для этой реакции берут стерильно в простерилизованную пробирку. Обязательным условием является исключение перед обследованием приема больным антибиотиков, которые оказывают токсическое действие на бледные трепонемы, вызывая их неспецифическое обездвижение. При содержании антибиотиков в сыворотке крови нарушается воспроизводимость реакции. Перед исследованием сыворотку крови инактивируют для разрушения возможно присутствующих в ней компонентов, обусловливающих неспецифическую иммобилизацию, которая может присутствовать в активных сыворотках крови. Антиген для РИБТ представляет собой взвесь бледных трепонем в среде выживания с количеством микроорганизмов 10-15 в каждом поле зрения. РИБТ протекает только при условии избытка комплемента. Для постановки РИБТ существуют методики - классическая методика с использованием газового меланжа для создания оптимальных условий выживания бледных трепонем и меланжерная методика, анаэробные условия при которой достигаются с помощью резинового кольца, закрывающего оба просвета меланжера. Через 18-20 часов после постановки реакции подсчитывают подвижные и неподвижные бледные трепонемы. Иммобилизация бледных трепонем от 0% до 20% соответствует отрицательным результатам реакции, от 21% до 30% - сомнительным, от 31% до 50% - слабоположительным, от 51% до 100 % - положительным. Положительные результаты РИБТ обнаруживаются примерно с середины вторичного свежего периода сифилиса, могут сохраняться некоторое время после проведенного лечения ("серологический рубец"). При необходимости реакция  воспроизводится  со спинномозговой жидкостью.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Применяются  следующие модификации:

• РИФ10 -   испытуемую сыворотку перед исследованием разводят в 10 раз, модификация рекомендуется для ранней серологической диагностики, отличается значительным процентом неспецифических положительных результатов;
• РИФ200 - в этой модификации значительно повышена специфичность реакции, приближающаяся к РИБТ, но наличие антител к антигенам непатогенных трепонем снижает чувствительность реакции;
• РИФабс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией, при этой модификации испытуемая сыворотка крови смешивается с сорбентом - трепонемным ультраозвученным антигеном с целью связывания групповых антител, что значительно повысило специфичность реакции.

 Модификацией  РИФабс является метод РИФабс с двойной окраской (FTA-ABS double staining, DS). При этом добавляется еще один краситель, обычно родаминовый красный, контрастирующий с флюоресцеином. Результаты обоих исследований выражаются как реактивные, слабореактивные, нереактивные или с наблюдаемым атипичным свечением.

При использовании РИФабс возможно получение ложноположительных результатов.

При необходимости для исследования спинномозговой жидкости используют РИФ с неразведенной цереброспинальной жидкостью.

В основе реакции пассивной гемагглютинации (РПГА, T. pallidum hemagglutination assay, TPHA) лежит способность проб, содержащих антитела, связываться с сенсибилизированными эритроцитами. Результаты исследования оценивают как реактивные, слабореактивные, нереактивные. Также возможно появление ложноположительных результатов. Гемагглютинационные тесты могут быть использованы как подтверждающие при обследовании большого  числа образцов.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) основан на принципе инкубации антигена с испытуемой сывороткой. Выпускаются тест-системы для автоматического учета и визуального наблюдения. В автоматизированном варианте этот тест можно принять для скрининга на сифилис больших групп обследуемых. Визуальные варианты применимы к КВД, клиникам и т.п. IgM-ИФА можно использовать в качестве как скринингового теста, так и подтверждающего. Он обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Согласно приказу Минздрава России № 87 от 26.03.01 рекомендовано к 2006 г. осуществить переход на новый комплекс серологических реакций, включающий либо РПГА,  либо ИФА в сочетании с микрореакцией или ее модификацией в количественном варианте.

В последние годы широко изучаются методы молекулярной биологии в диагностике сифилиса. Изучаются также методы ДНК-зондов, полимеразная цепная реакция.

Ирина ХАМАГАНОВА,

 профессор.

 Российский государственный медицинский университет.