Адресат - печень
Изначально генетическая (генная) терапия (ГТ) зарождалась как средство лечения наследственных заболеваний путем коррекции ошибочных нуклеотидов в геномной ДНК. Исследователи пока только "нащупывают" подходы к решению проблемы в такой ее постановке. В настоящее время в практику входят методы генотерапии, основанные на адресном введении плазмидной ДНК, содержащей функциональные гены, обеспечивающие синтез необходимого белка, с помощью вирусных систем или адресной доставки, обычно углевод-содержащих липидных векторов. На взгляд ученых, работающих в области генной терапии, способ и системы доставки генетического материала в организм представляют собой ключевую задачу этой биомедицинской технологии.
О своих разработках и подходах к проблеме генного переноса в целях генотерапии рассказывают ведущие специалисты НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН: заведующий лабораторией функциональной геномики и липидомики, профессор Ренат ЖДАНОВ и ведущий научный сотрудник лаборатории, кандидат биологических наук Елена БОГДАНЕНКО.
Быстрого прогресса найти не удалось
Молекула ДНК стала сейчас, по мнению профессора Р. Жданова, одновременно и энциклопедией (структура генома), и мощным лекарством, дающим надежду на излечение от многих заболеваний. Одним из важнейших практических достижений молекулярной биологии и генетики в медицине является разработка методов генодиагностики наследственных болезней, а также вирусных и микробных инфекций, которые основаны на молекулярной гибридизации, полимеразной цепной реакции и иммунохимии. С помощью этих методов можно локализовать генетические повреждения, идентифицировать ультрамалые количества возбудителей микробных или вирусных инфекций, а также следить за эффективностью генной терапии. Оба направления - генодиагностика и генотерапия - неразрывно связаны между собой.
Для многих специалистов, к сожалению, стало очевидно, что, несмотря на значительный прогресс, быстрого успеха в ГТ достигнуть не удалось: до сих пор ни одна болезнь не побеждена и в клинике нет завершенного метода лечения. Терапия наследственных заболеваний находится на начальном этапе, так как не решена проблема корректировки самого генома, а ее развитие пошло по пути реализации экстрахромосомной экспрессии введенных генетических конструкций. Генотерапия злокачественных новообразований с помощью генов цитокинов, генов самоубийства клеток, генов, контролирующих апоптоз, и ряда других генетических конструкций не гарантирует, к сожалению, полного излечения, так как, если в результате лечения остаются даже единичные трансформированные клетки, то опухоль может дать рецидив. Проблема ВИЧ-инфекции также не решена, хотя есть и определенные перспективы создания соответствующей вакцины.
Профессор Р.Жданов полагает, что существуют, по крайней мере, две следующие крайне важные и не решенные до сих пор проблемы ГТ - это низкая эффективность существующих методов переноса и экспрессии генов в клинических протоколах и отсутствие адресных систем доставки в целевые клетки и ткани, обеспечивающих высокий уровень экспрессии терапевтических генов в организме.
Лечебный эффект генных терапевтических средств достигается обычно в следующих случаях: в результате корректировки или замены дефектного гена (генетическая терапия); в результате экспрессии (экстрахромосомной) введенного терапевтического гена (генная терапия); или как результат подавления функции "больного" либо сверхактивного гена (антисэнс Т.).
Работы по доставке генов in vitro в экспериментах с культурами эукариотических клеток ведутся уже в течение более десяти лет, благодаря чему разработан целый ряд эффективных методик. Что же касается переноса генов в животные организмы, то этот вопрос изучен гораздо меньше. Дело в том, что транспорт в целевые клетки в них гораздо более сложен и многоэтапен, включает в себя преодоление множества системных физиологических и структурных барьеров. Среди них - барьеры с разной проницаемостью (например, эндотелий стенки сосудов), иммунный надзор, метаболическая деградация вводимых веществ. В отличие от большинства фармакологических препаратов с низкой молекулярной массой и, соответственно, низкой иммуногенностью, вводимые генотерапевтические конструкции имеют массу, способную привести к возникновению иммунного ответа. Таким образом, получается, что для транспорта макромолекулярных комплексов важны взаимодействия как на молекулярном и клеточном, так и суборганном, органном уровнях и уровне организма.
Если говорить о способе введения генетических конструкций, то он подразумевает как системное введение (внутривенно, внутримышечно), так и локальное (сосуды, органы, опухоли). Многие существующие клинические протоколы ГТ основаны на локальном введении генетических конструкций. Исходя из типа "векторной системы", выделяют протоколы ГТ, использующие вирусные векторы, невирусные системы, и физические методы (микроинъекции, "генный пистолет", электропорация).
Плюсы и минусы вирусных и невирусных систем доставки
Вирусные векторы обычно обеспечивают более эффективный перенос функциональных генов по сравнению с невирусными системами. Преимущество первых заключается в высокой специфичности и эффективности генного переноса. Имеются в виду сродство к определенным тканям (скажем, векторы на основе вируса простого герпеса обладают тропностью к нервной ткани), а также наличие ядерного сигнала, обеспечивающего высокий уровень экспрессии вносимых генов в клеточном ядре. Но у вирусных систем доставки есть и минусы. В частности, ретровирусы, на основе которых были созданы первые вирусные векторы, потенциально патогенны, поскольку обладают онкогенными последовательностями и другими нежелательными эффектами.
В отличие от вирусных, большинство невирусных систем относительно безопасно, не обладает мутагенностью и низкотоксично. В настоящее время существуют три основные группы методов переноса функциональных генов без участия вирусов. В первом случае - это использование "голой" нуклеиновой кислоты, когда плазмидная ДНК может быть непосредственно трансфицирована в мышечные клетки с помощью прямых инъекций, она может быть введена с помощью электропорации или так называемого "генного пистолета", стреляющего микрочастицами из золота/вольфрама с нанесенной на них ДНК.
Первому подходу - ДНК-иммунизации - сейчас придается большое значение, им активно занимаются многие лаборатории за рубежом и у нас в стране. В США созданы даже фирмы, специализирующиеся на так называемой "трансдермальной" ДНК - иммунизации, то есть внесении генетических конструкций в организм через кожу с помощью специальных кремов.
Второй способ (липофекция) заключается в применении катионных липосом, при котором ДНК спонтанно связывается с их катионными липидами, нейтрализуя свой отрицательный заряд. Образующиеся при этом комплексы - липоплексы или геносомы взаимодействуют с клеточной мембраной.
В третьем случае используются искусственные макромолекулярные системы, при которых эффективность переноса и доставки генов in vivo может быть существенно улучшена по сравнению с эффективностью при липофекции. Важными группами таких векторов являются системы, которые содержат специальные сигналы, обеспечивающие транспорт генов в ядро, а также полисахариды и углеводные адресные группы, которые транспортируют генетические конструкции/липоплексы лишь в определенные ткани.
По выражению профессора Индера Верма, в генной терапии имеются три основные проблемы: это - доставка (генов), доставка и доставка. В связи с этим хотелось бы коснуться важности соотношения вирусных и невирусных векторов для переноса терапевтических генов, в связи с недавним трагическим случаем в США - смертью одного пациента. Он страдал недостаточностью гена орнитинкарбамоилтрансферазы и погиб в результате применения аденовирусного вектора третьего поколения. Эта смерть поколебала устои клинической генотерапии, как их понимали ведущие клиницисты
США. Отец жертвы дошел до сенатской комиссии по вопросам здравоохранения, которая рассмотрела эту проблему. Самое интересное заключалось в том, что никто так и не понял, почему же это случилось. Врачи, проводившие лечение шести групп пациентов (по три человека в каждой), сделали все необходимое, на их взгляд, чтобы избежать летального исхода при этом клиническом протоколе. Однако на четвертый день, после третьей инъекции аденовирусного вектора с этим геном пациент умер. В протоколе был использован, казалось бы, безопасный аденовирусный вектор третьего поколения. Вскрытие показало, однако, атрофию внутренних органов, по-видимому, по механизму апоптоза. Складывается впечатление, что мы стали свидетелями нового, неизвестного ранее явления взаимодействия генома вируса с геномом человека. Это представляется тем более вероятным, что в литературе уже были известны указания на то, что в аденовирусах есть нуклеотидные последовательности, активирующие цитотоксические механизмы, которые, вероятно, и сработали в данном случае. Поэтому к применению вирусных векторов надо подходить с еще большей осторожностью, чем ранее, и шире внедрять в клиническую практику невирусные векторы.
Новый агент для адресной доставки ДНК
- Когда в нашей лаборатории мы изучали (с помощью физико-химических и цитологических методов) свойства липоплексов - комплексов ДНК и различных липидов, то обнаружили, что некоторые липоплексы направляются преимущественно в органы выделения - в печень и почки, - говорит профессор Р.Жданов. - Это дает перспективы использования некоторых соединений, конкретно, лактозилированного липида, в генной терапии заболеваний печени - ключевого органа, отвечающего за метаболизм. Работы по экспериментальной генной терапии печени выполняются на животных, в основном на мышах. Людям вводились только вирусные вектора, которые имели в своей основе часть вируса, например, герпеса, аденовируса или цитомегаловируса, и то не для лечения заболеваний печени как таковых, а для продления жизни пациентов с метастазами в этом органе. Невирусные системы переноса генов, в основном, остаются недостаточно эффективными для использования на людях. Такими переносчиками представляют собой липосомы или микросферы, которые необходимы, чтобы защитить ДНК от внутренней среды организма.
Результат взаимодействия липосом с тканями организма обычно определяется способом введения. Например, при оральном способе липосомы разрушаются в пищеварительном тракте, при введении в кроветок происходит их захват клетками ретикуло-эндотелиальной системы - печени и селезенки.
- Для того, чтобы проверить, насколько эффективны перенос ДНК и ее биораспределение в комплексах с веществами-переносчиками, - говорит Елена Богданенко - мы использовали ДНК, меченую изотопом углерода 14С. Это дало возможность установить, что при введении липоплексов в хвостовую вену мыши радиоактивность в печени быстро снижается, причем максимум метки через один день наблюдается в легких или почках. Если вводить геносомы в хвостовую вену (система нижней полой вены), это приводит к экспрессии генов во многих тканях, в том числе и в печени, однако максимальная экспрессия отмечается в эндотелиальных клетках легких: приблизительно в два-три раза выше, чем в других тканях с высоким ее уровнем. Это явление объясняется "эффектом первого прохода", поскольку легкие являются первой капиллярной сетью, встречающейся комплексу липосом с ДНК в кровяном русле, и имеют самую большую площадь поверхности капилляров. Следующим органом на пути комплексов является сердце, поэтому нет ничего удивительного, что именно в нем наблюдается обычно второй по величине уровень экспрессии.
В последнее время многие исследователи проявляют большой интерес к различным поли- и олигосахаридам, "узнаваемым" лектинами - специфическими белками-рецепторами, находящимися на поверхности клеток. Главные усилия направлены сейчас на поиск олигосахаридов, которые могут оказаться специфичными, а значит, и наиболее эффективными "векторами" для переноса генов в определенные типы клеток, тканей или органов.
Перспективы
В настоящее время с помощью генетической терапии можно лечить более 100 заболеваний печени. Сейчас в американских госпиталях развивается даже педиатрическая ГТ. На сегодняшний день генная диагностика позволяет проводить у детей раннюю диагностику врожденных заболеваний печени и лечить их на ранней стадии, когда они еще не запущены. Поэтому многие эксперименты в экспериментальной генной терапии проводятся именно на новорожденных животных.
Среди заболеваний печени, которые можно лечить таким методом, можно назвать дефицит глюкоуронилтрансферазы - фермента, способствующего выведению чужеродных соединений с мочой. Это заболевание так же часто встречается у детей, как и тирозинемия - системное поражение клеток печени. Не менее распространена и фенилкетонурия, приводящая к задержке ментального развития; или, например, вирусные заболевания - те же гепатиты. С помощью подобных методов можно лечить и диабет.
Профессор Р.Жданов считает, что основная цель исследований в области генной терапии, которые в ближайшее время приведут, по-видимому, к значимому успешному результату, - это разработка новых систем, сочетающих в себе элементы как вирусных, так и невирусных векторов. Они должны достигать специфических клеток, обеспечивать эффективный генный перенос в высокий процент этих клеток, внедряться в определенные области генома. Они могут регулироваться введением определенных реагентов или собственными сигналами организма, будут экономичны и смогут обеспечивать необходимый терапевтический результат. В клинических протоколах, которых сейчас насчитывается уже более 400, появятся первые инъекционные векторы, в ряде случаев станет доступным тканеспецифичный перенос терапевтических генов.
Все компоненты, составляющие векторы будущего и содержащие элементы вирусных и невирусных систем, будут, по-видимому, собраны в частицы с клеточным адресом и ядерным сигналом с учетом уменьшения иммуногенности и взаимодействия с ретикуло-эндотелиальной системой. Лекарства будущего можно представить себе в виде клеток или тканей, генетически модифицированных с помощью векторных систем, содержащих компоненты как вирусов, так и искусственных макромолекулярных комплексов. Таким образом, генная и генно-клеточная терапия, наряду с клеточной терапией (стволовые клетки) рассматривается сейчас как основа для современной медицины.
Подготовила Татьяна КУЗИВ.