ЭРИТРОПОЭТИН: ОТКРЫТИЯ И ДОСТИЖЕНИЯ
Эритропоэтин, гормон эритропоэза, в противоположность многим "классическим" гормонам, прошел длинный путь через череду открытий и заблуждений к потрясающим научным и клиническим достижениям. Несмотря на все былые неудачи, разочарования и трудности, этот "мифический" или "неуловимый" объект неустанных поисков ученых стал реальностью, обрел молекулярно-генетические очертания и, что особенно важно, нашел широкое клиническое применение.
Сквозь сомнения и неудачи
Постоянный уровень эритроцитов в организме поддерживается строгой координацией между образованием и разрушением клеток красной крови (эритроидных клеток). В нормальных условиях эти противоположные процессы находятся в состоянии устойчивого динамического равновесия, которое поддерживается регуляторными механизмами. Долгое время считали, что фактором, регулирующим эритропоэз, является величина кислородного напряжения в костном мозгу. Предполагалось, что костный мозг даже в норме испытывает некоторое кислородное голодание, которое оказывает прямое стимулирующее действие на эритропоэз. Эта "гипоксическая" теория находила подтверждение в опытах и наблюдениях, показавших резкое увеличение образования эритроцитов при понижении парциального давления в воздухе, и, следовательно, в крови.
Однако прямое стимулирующее влияние гипоксии на эритропоэз доказать не удалось. Напротив, выяснилось, что для усиления деятельности эритроидного костного мозга необходимо нормальное или даже повышенное содержание кислорода. После тщательных и многолетних исследований удалось установить, что гипоксия стимулирует эритропоэз в костном мозгу не прямо, а путем образования гуморального медиатора - эритропоэтина.
Столетие со дня рождения гипотезы о гуморальной регуляции эритропоэза можно условно разделить на три периода: 1) гуморально-клеточный, 2) молекулярно-генетический и 3) клинический.
В 1906 г. Carnot и Deflandre впервые обнаружили, что сыворотка крови кроликов, полученная через 20 часов после кровопускания, стимулирует эритропоэз у нормальных кроликов-реципиентов. После парентерального введения такой "анемической" сыворотки у животных развивался эритроцитоз с нормобластической гиперплазией и увеличением числа митозов в костном мозгу. Стимулирующее действие сыворотки авторы этого открытия объясняли появлением в ней эритропоэтически активного вещества, названного ими "гемопоэтином". Эритропоэтическая активность была обнаружена также и в сыворотке крови животных, помещенных на несколько часов в барокамеру с низким парциальным давлением кислорода, а также после введения гемолитического яда - фенилгидразина.
В 30-х годах появились сообщения нескольких авторов, которые отрицали или ставили под сомнение присутствие "гемопоэтина" в сыворотке крови анемизированных или "гипоксических" животных. Эти работы на два десятилетия значительно ослабили интерес ученых к концепции о гуморальной регуляции эритропоэза. Однако в начале 50-х годов появились новые и оригинальные данные, убедительно доказавшие существование "гемопоэтина". В 1950 г. Reissman на парабиотических крысах доказал, что влияние гипоксии на костный мозг осуществляется не прямым путем, а посредством образования гуморального фактора, названного "эритропоэтином", объяснял неудачу некоторых прежних опытов слишком малым количеством вводимой сыворотки. И действительно, Erslev в 1953 г. после введения нормальным кроликам "анемической" плазмы по 50 мл ежедневно в течение 4 дней наблюдал на 5-6-й день от начала инъекций повышение числа ретикулоцитов в 3-4 раза, а после 13 инъекций - значительное увеличение числа эритроцитов, величины гематокрита и процента эритроидных клеток в костном мозгу.
Дальнейшим толчком к изучению эритропоэтина послужили клинические наблюдения над случаями вторичного эритроцитоза у пациентов с незаращенным боталловым протоком (Stohlman, 1954). У этих пациентов насыщение и давление О2 в крови подключичной артерии и в костном мозгу грудины было нормальным, тогда как эти величины в бедренной артерии и в костном мозгу подвздошной кости - значительно уменьшены. Однако и в нормально оксигенированном костном мозгу грудины и в гипоксическом костном мозгу подвздошной кости была обнаружена эритроидная гиперплазия. Эти наблюдения исключали прямое стимулирующее влияние гипоксии на костный мозг и доказывали ее действие посредством образования эритропоэтина.
Итак, эритропоэтин (ЭПО) образуется в условиях гипоксии. Но в каком органе или в какой ткани? Вопрос о месте образования ЭПО в организме был спорным и противоречивым, пока в 1957 г. в лаборатории Jacobson не было обнаружено, что после двухсторонней нефрэктомии крысы и кролики утрачивают способность реагировать на кровопускание или на введение солей Co++ (вызывают тканевую гипоксию) повышением титра ЭПО в плазме. Проведенные в дальнейшем многочисленные и разнообразные экспериментальные и клинические наблюдения установили непреложный факт, что главным местом образования ЭПО являются почки.
В 60-е годы появились первые работы по изучению механизмов на клеточном и молекулярном уровнях, были разработаны высокочувствительные методы определения ЭПО в сыворотке крови (с-ЭПО) и методы клонирования коммитированных эритроидных предшественников - бурстобразующих и колониеобразующих эритроидных единиц (БОЕ-Э и КОЕ-Э). В 1976 г. Международной комиссией по биохимической номенклатуре (JUPAC-JUB) ЭПО был признан гормоном и включен в Международную классификацию пептидных гормонов.
Гипоксия - главный стимул для образования ЭПО. Под ее влиянием кислородный сенсор в почках индуцирует синтез гормона, который поступает в циркуляцию крови и действует на клетки-мишени в костном мозгу (БОЕ-Э и КОЕ-Э) В результате взаимодействия между ЭПО, ЭПО-чувствительными клетками (ЭЧК) и их микроокружением возникает ответная реакция, а именно - дифференциация, пролиферация и созревание эритроидных предшественников. Кроме того, ЭПО предотвращает апоптоз эритроидных предшественников, то есть способствует их выживаемости, уменьшая таким образом неэффективный эритропоэз.
Выделение гена
Молекулярно-генетический период истории ЭПО начинается с успешного выделения и очистки нескольких миллиграммов гормона из огромного количества мочи (1500 л) пациентов с апластической анемией в 1977 г. По биохимической природе ЭПО относится к группе кислых гликопротеинов. Эти соединения представляют собой белки, содержащие в качестве простетических групп гетеросахариды с небольшим числом моносахаридных остатков, присоединенных ковалентно к полипептидной цепи. Такие конзюгированные с углеводами белки обладают характерной повышенной растворимостью и термостабильностью. Первичная структура ЭПО стала известной в 1980 г. в связи с успехами в области молекулярной биологии. Клонирование и экспрессия гена ЭПО, расположенного на хромосоме 7 в области 11-22, позволили охарактеризовать молекулярные процессы синтеза ЭПО. На модели "эндокринной" почки по Г.Селье было показано, что биогенез ЭПО происходит по обычной схеме образования белка и включает в себя депрессию синтеза РНК, специфичных для гормона (Е.Морщакова, 1978).
После успешного выделения и клонирования ЭПО-гена в разных лабораториях были разработаны модели O2-ceнcopныx механизмов экспрессии ЭПО-гена (Fandrey, 1990; Fisher, 1993). На основании предложенных моделей можно сделать заключение, что существуют, вероятно, множественные пути восприятия кислорода в ЭПО-продуцирующих клетках. Клеточные сенсоры О2 дают возможность клеткам "зондировать" наличие кислорода в их окружении и регулировать функции клетки-продуцента ЭПО. Эти функции направлены на ликвидацию любого несоответствия между потребностями в кислороде и снабжением им. Наиболее привлекательной гипотезой, на наш взгляд, является идея о вовлечении гемового белка в молекулярные механизмы кислородного сенсора в ЭПО-продуцирующих клетках. Механизмы могут быть связаны с окси-деоксиконформационными изменениями гемового белка или с продукцией реактивных видов кислорода из молекулярного. Областью почки, где располагаются О2-сенсорные и ЭПО-вырабатывающие клетки является корковый слой.
Функции ЭПО передаются посредством специфического ЭПО-рецептора (ЭПО-Р). Недавнее клонирование ЭПО-Р-гена значительно облегчило молекулярный анализ структуры и функции этого рецептора. Ген для ЭПО-рецептора обнаружен на хромосоме 19 у человека; он кодирует белок, состоящий из 507 аминокислот и содержащий одну связанную с мембраной область. ЭПО связывается с двумя молекулами ЭПО-Р. Это приводит к гомодимеризации рецептора с последующей активацией нескольких путей сигнальной трансдукции (передачи сигнала). ЭПО генерирует сигналы как для дифференциации, так и для пролиферации эритроидных коммитированных предшественников. Эритроидная дифференциация в молекулярном аспекте означает экспрессию генов, определяющих синтез специфических белков эритрона, главным образом гемоглобина.
Нормальная функция системы эритрона обусловлена тремя основными компонентами: нормальной почечной продукцией ЭПО, функционирующим эритроидным костным мозгом и адекватным снабжением субстратами (железом). Дефект какого-либо из этих компонентов может привести к развитию анемии. Показателем почечной продукции ЭПО является содержание ЭПО в сыворотке крови. Продукция ЭПО регулируется в узких пределах, и уровень с-ЭПО не повышается за пределы нормы (6-25 мМЕ/мл) до тех пор, пока концентрация Hb не падает ниже 100-120 г/л. При наличии нормального ЭПО-образующего аппарата в почках уровни гормона в сыворотке повышаются экспоненциально уменьшению концентрации Hb или гематокрита. В этих случаях почечная продукция ЭПО в ответ на вызванную анемией гипоксию является адекватной. Примерами адекватной продукции ЭПО могут быть: железодефицитная анемия, гемолиз, кровопотеря, апластическая анемия, неэффективный эритропоэз. При неадекватной продукции ЭПО в ответ на анемию наблюдается ослабление или даже утрата регулируемой зависимости с-ЭПО от уровня Hb относительно такой зависимости у "эталонных" пациентов с адекватной реакцией ЭПО на данную степень анемии. Как правило, в качестве эталона используют корреляцию уровней с-ЭПО и Hb у пациентов с железодефицитной анемией. Неадекватная продукция ЭПО наиболее часто наблюдается у пациентов с хронической почечной недостаточностью, хроническими болезнями, злокачественными новообразованиями.
"Клиническая эра"
Революционным событием в истории ЭПО стало получение реком-бинантного человеческого ЭПО (рч-ЭПО) методами генной инженерии. Разработка методов получения рч-ЭПО была кооперативной, многонациональной и включала усилия ученых и специалистов фармацевтических компаний. Испытания полученного препарата (эпоэтин-альфа) на животных, донорах-добровольцах и в клинике были проведены в Европе, США, Канаде и в Японии и дали блестящие результаты. Препарат оказался высокоэффективным и почти без побочных эффектов. Первые публикации результатов клинических испытаний рч-ЭПО для лечения анемии пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) появились уже в 1986-87 гг. Результаты превзошли все ожидания, и началась "клиническая эра" ЭПО, который стал использоваться для лечения целого ряда анемий с низкой и неадекватной продукцией эндогенного гормона.
В настоящее время рекомбинантный человеческими ЭПО является альтернативой гемотрансфузиям. Главными целями применения рч-ЭПО являются: профилактика и лечение анемии, уменьшение или исключение объема и количества гемотрансфузий и улучшение качества жизни пациентов. Все препараты рч-ЭПО хорошо переносятся, дают высокий процент ответной реакции (от 70 до 95% пациентов) и могут применяться в амбулаторных условиях и даже на дому.
Клиническое применение рч-ЭПО
Заместительная терапия (низкий уровень эндогенного ЭПО):
1. Хроническая почечная недостаточность.
2. Злокачественные новообразования.
3. Хронические болезни.
4. Недоношенность.
5. ВИЧ-инфекция.
6. Беременность.
Поддерживающая терапия:
1. После химио- и лучевой терапии.
2. После трансплантации костного мозга/стволовых клеток.
Стимулирующая терапия (повышение Hb выше нормы):
1. Хирургия (до и после операции).
2. Ситуации, когда запрещены гемотрансфузии (например, у секты иеговистов).
Другие случаи:
1. Острая почечная недостаточность.
2. Критические состояния.
3. Нейропротекция.
4. Ишемическая болезнь сердца.
В нашем научно-клиническом центре (Рязанский филиал) рч-ЭПО с успехом используется для лечения и профилактики анемии при злокачественных новообразованиях, для лечения анемии недоношенных детей и анемии хронических болезней, при критических состояниях. Наш 12-летний опыт применения рч-ЭПО в педиатрической практике показал важность использования ряда критериев, определяющих тактику ведения пациентов при ЭПО-терапии. Такими критериями являются:
1. Уровень эндогенного (сывороточного) ЭПО - с-ЭПО.
2. Уровень гемоглобина, гематокрита и число ретикулоцитов.
3. Целевой уровень гемоглобина или гематокрита, который планируется достичь в результате лечения.
Анализ этих критериев при различных видах анемии позволяет спланировать дозировку и режим ЭПО-терапии. Рациональный протокол применения рч-ЭПО особое значение имеет в детской клинике, где замена гемотрансфузий на рч-ЭПО является одной из главных задач для врача.
В силу исторических и физиологических причин активация и сигнализация системы ЭПО/ЭПО-Р хорошо изучены в эритроидных клетках. Поэтому была принята догма, что ЭПО действует только на эти клетки. Однако совсем недавно стало ясно, что ЭПО-Р экспрессируется во многих органах и тканях (головной мозг, сердце, эндотелий, матка, женские и мужские репродуктивные органы, глаз). Наиболее активно при этом изучалась биология ЭПО в ЦНС. Оказалось, что ЭПО продуцируется нейронами и астроцитами и является биологически активным. В паракринной системе мозга ЭПО связывается с рецептором на смежной клетке и поэтому не поступает в циркуляцию крови. Система ЭПО/ЭПО-Р в ЦНС оказывает антиапоптозное, антиоксидантное и прямое нейротрофическое действие, а также стимулирует ангиогенез (капиллярные эндотелиальные клетки вырабатывают нейротрофины).
Таким образом, существует, вероятно, три отличных друг от друга системы действия ЭПО: 1) эндокринная, гормональная система, в которой ЭПО действует как гормон (он вырабатывается в одной ткани и транспортируется в плазме к ткани-мишени, 2) паракринная система, где клетки вырабатывают ЭПО, который связывается с рецепторами на смежных клетках, 3) аутокринная система, в которой сама клетка вырабатывает и использует ЭПО.
Экспрессия ЭПО-Р и ЭПО играет особенно важную роль (кроме доминирующего значения в регуляции эритропоэза) в ЦНС. Различные исследования свидетельствуют о том, что ЭПО оказывает трофический и защитный эффекты в поврежденной ЦНС целым рядом механизмов, включая антиапоптозный и антивоспалительный механизмы, а также иммунную и электрофизиологическую модуляцию. Изменения в экспрессии ЭПО-Р играют ключевую роль в активации этих механизмов. В исследованиях человеческого головного мозга после ишемии и/или гипоксии ЭПО был определим в сосудистой ткани и в воспалительных клетках, а ЭПО-Р обнаруживался в кровеносных сосудах и в отростках нейронов и астроцитов в пределах инфарктов и в периинфарктной зоне. На моделях животных было показано, что внутривенное введение рч-ЭПО оказывает нейропротекторное действие после ишемии мозга, механической травмы, интоксикации, воспаления и дегенерации мозговой ткани.
Система ЭПО/ЭПО-Р выполняет защитную роль не только при повреждении ЦНС, но и при повреждениях других органов (например, при ишемической болезни сердца). Таким образом, полное изучение системы ЭПО/ЭПО-Р может значительно расширить терапевтическое использование рч-ЭПО не только для лечения анемии, но и в направлении регенерации и восстановления поврежденных тканей и органов.
Анатолий ПАВЛОВ,
профессор.
Елена МОРЩАКОВА,
профессор.
Рязанский филиал ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии.