Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии. (Методические рекомендации)

Белобородова Н.В. Курчавов В.А. Бойко Н.Б. Минаев В.А. Демина А.М. Поздоровкина В.В. Кульганек В.В. Осипов Г.А. Бирюков А.В. Титкова Н.Ф. Ходорковская В.А. Радюшина Т.В. Рогатина Е.Л. В В Е Д Е Н И Е Современная клиническая медицина предъявляет все возрастающие требования к комплексу лабораторных исследований, применяемых для диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний. Ввиду сложности бактериологических методик выделения и идентификации анаэробов, отсутствия коммерческих, специальных, питательных сред и надежной анаэробной техники, исследования на анаэробы в обычных клинических лабораториях страны еще недостаточно налажены. Между тем, для выбора адекватных антибактериальных агентов и эффективного лечения гнойных инфекций, требуется быстрое определение возбудителя и его надежная идентификация. Наряду с трудоемкой, длительной и сложной бактериологической диагностикой, существуют нетрадиционные приемы зкспресс-диагностики анаэробов. В стадии изучения находятся характеристики иммунофлуоресцентного, иммунопероксидазного, радиоиммунного и метода встречного электрофореза. Ведущим методом экспресс-диагностики анаэробной инфекции является метод газовой хроматографии (ГЖХ-анализ). Ценность хроматографических методов для научных исследований в области микробиологии и медицины в настоящее время общепризнанна. Однако внедрение ее в медицинскую практику пока еще сдерживается отсутствием простых и надежных методик, пригодных для использования в условиях клинических лабораторий. Основными преимуществами метода являются: -быстрота выполнения исследования (30-40 мин); -высокая информативность (ориентировочная идентификация возбудителя по спектру до рода и вида); -высокая чувствительность (10--6 г/л); -возможность проведения исследования биологических жидкостей организма при труднодоступной локализации патологического очага; -возможность контроля эффективности лечения В данных рекомендациях использован метод газохроматографического анализа, позволяющий провести исследование химического состава среды на содержание летучих жирных кислот, дикарбоновых и фенилзамещенных кислот, после роста различных анаэробных микроорганизмов. Полученные данные по химическому составу культуральных сред могут быть использованы как дополнительный тест при лабораторной диагностике анаэробной инфекции и в качестве таксономического теста микроорганизмов. Приводится методика определения диагностически значимых летучих жирных кислот в биологическом материале хирургических больных и варианты ее использования в педиатрии, в частности, в детской хирургии. Особенно актуально применение данного экспресс-метода в случаях, требующих срочного хирургического вмешательства. ОПИСАНИЕ МЕТОДА ФОРМУЛА МЕТОДА Предлагается стандартная экспресс-методика для дифференциации различных видов монокультур анаэробов на основании данных ГЖХ-анализа продуктов их жизнедеятельности. Культивирование проводилось на пептонно-дрожжевой среде, которая дает возможность получить достоверные информативные компоненты. В данной методике помимо известных продуктов метаболизма - летучие жирные кислоты (ЛЖК), нелетучие жирные кислоты (НЭЖК) используются дополнительные информативные компоненты (ароматические кислоты, амины) .Систематизированы данные по следующим представителям анаэробной микрофлоры: Вacteroides fragilis,* Bacteroides intermedius, Bacteroides ovatus, Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides melaninogenicus, Bacteroides bivius, Bactreroides vulgatus, Bacteroides tretaiotaomicron, Clostridium perfringens, Clostridium histolyticum, Clostridium novui, Clostridium septicum Propionbacterium acnes, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium necrophorum, Peptostreptococcus spp., Bifidobacterium adcfescenti, Lactobacillus auid, Veillionella parvula * Изучаемые культуры были получены из ГИСК им.Л.А.Тарасевича и ЦНИИЭ. Впервые определены фоновые концентрации ЛЖК в биологических средах у детей. Доказана более высокая информативность выявления ЛЖК из биологических сред при хирургических заболеваниях у детей, протекающих с участием неспорообразующей анаэробной микрофлоры, по сравнению с традиционными методами лабораторной диагностики. Предложено использование нового теста для экспресс-диагностики инфекций, протекающих с участием анаэробов любой локализации у детей, косвенно, путем определения концентрации ЛЖК в моче методом газовой хроматографии. МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Материалы для идентификации монокультур анаэробов Культуры, выделенные из клинического материала, культивируют в течение 48 часов на пептонно-дрожжевой среде следующего состава: пептон- 20,0 г дрожжевой экстракт-20,0 г солевой раствор- 40,0 г цистеин гидрохлорид - 0,5 резорцина раствор- 4,0мл вода- 1000,0мл РН среды- 7,2 Солевой раствор имеет следующий состав: CаCl2- 0,2г MgSO4-0,2г К2HPO4-1,0 г КH2PO4- 1,0 г NaHCO3 - 10,0 г NaCl - 2,0 г Образцы культур клостридий были выращены также на бульоне Вейнберга при температуре 37°С в течение 18-24 часов. На анализ брали надосадочную жидкость после центрифугирования . 1.2.Материалы для диагностики инфекции, протекающей с участием анаэробов в биологических жидкостях пациента Материалом исследования больных с “острым животом” служит содержимое брюшной полости (полученное при лапароскопическом методе исследования или во время операции), венозная кровь и / или моча. У больных с остеомиелитом исследовали кровь, пункционный и операционный материал, полученный при открытой биопсии и / или мочу. У урологических больных исследуют венозную кровь, мочу и содержимое дренажных трубок. У новорожденных с аспирационной пневмонией исследуют трахео-бронхиальный экссудат, при септических состояниях - кровь. Забор мочи производится перед операцией в стерильную пробирку в количестве 5 мл. Забор 1 мл венозной крови для исследования, производится во время операции, у тех детей, которым требуется инфузии лекарственных препаратов. Забор жидкости из брюшной полости производится во время лапароскопии, у детей с подозрением на острый аппендицит и абдоминальную форму крипторхизма, с помощью отсоса в количестве 1-2 мл. 2. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И УСЛОВИЯ АНАЛИЗА 2.1. Культуральные среды Методические рекомендации отработаны на приборе фирмы Hewlett Packard 5880 A c пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой 1,6 м длиной и 2 мм внутренним диаметром. Колонка заполнена 10% АТ-1000+ 1%H3PO4 на Сhromosorb W-AW/ 100-120mesh. Раходы газов: газ-носитель - гелий- 60 мл/мин водород - 30 мл/мин воздух - 300 мл/мин Температура детектора -260°С Tемпература испарителя- 250°С Температура термостата колонок изменялась в режиме программирования температуры от 80°С до 210 °С со скоростью 5° /мин. Для ГЖХ-анализа также может быть использован любой другой газовый хроматограф, имеющий близкие технические характеристики. 2.2. Биологические жидкости ГХ-определение проводили на хроматографе серии GC-14 A фирмы “Shimadzu, с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой FFAP длиной 25м с внутренним диаметром 0,2 мм в изотермическом режиме (150° С ). Раходы газов: газ-носитель - гелий- 1 мл/мин водород - 30 мл/мин воздух - 300 мл/мин Температура детектора -250°С Для ГЖХ анализа также может быть использован любой другой газовый хроматограф, имеющий близкие технические характеристики. Появились новые газовые хроматографы фирмы Agilent Technology (бывшая Hewlett Packard), например, АТ-5990A. 3. СТАНДАРТНЫЕ СМЕСИ КИСЛОТ Для идентификации компонентов использовали стандартную смесь (10 мМоль каждого компанента в 100 мл водного раствора) Таблица 1. Стандартная смесь летучих кислот /ЛЖК/ Название кислоты Содержание кислоты, мг в 100мл водного раствора уксусная 600.5 пропионовая 740.8 изомасляная 881.0 масляная 881.0 изовалериановая 1021.3 валериановая 1021.3 изокапроновая 1161.6 капроновая 1161.6 гептановая 1301.9 Для получения колибровочной смеси разбавляли стандартную смесь до концентрации 0.4 мкМоль/мл. Для анализа отбирали 1 мл смеси, добавляли 40 мкл (2 капли) 50% Н2SO4 и 1 мл серного эфира. Смесь герметично закрывали и энергично встряхивали. После разделения слоев, верхний эфирный слой отбирали в чистую пробирку. Экстракцию проводили дважды. Затем упаривали эфир до объёма 100 мкл. Для ГЖХ анализа отбирали 1 мкл эфирного экстракта. Хроматограмма стандартной смеси летучих кислот показана на рис.1. Рис.1 Таблица 2. Стандартная смесь нелетучих кислот /НЖК/. Название кислоты Содержание кислоты,мг в 100 мл водного раствора пировиноградная 88,06 молочная 90,08 щавелевоуксусная 66,04 щавелевая 45,02 метилмалоновая 59,05 малоновая 52,03 фумаровая 58,04 янтарная 59,05 Для получения метиловых эфиров отбирали 1 мл стандартной смеси, добавляли 0,4 мл 50% Н2SO4 и 2 мл метанола. Прбирки плотно закрывали и нагревали 30 мин при 60 °С. К смеси, после охлаждения до комнатной температуры, добавляли 0,5 мл хлороформа и 1 мл дистиллированной воды. Нижний слой хлороформа отбирали в чистую пробирку. Для ГХ-анализа отбирали 5 мкл хлороформенного экстракта. 4. Подготовка пробы к анализу 4.1.Анализ летучих кислот культуральной среды В продуктах метаболизма определяли следующие летучие кислоты: уксусная, пропионовая изо-масляная масляная, изовалериановая изокапроновая капроновая энантовая 2 мл культуральной среды после отделения выращенной культуры помещали в пробирку, добавляли 0,2 мл 50% H2SO4, 0,4 г NaCl и 1 мл серного эфира. Пробирку тщательно закрывали и энергично встряхивали. После разделения слоев центрифугированием, в чистую пробирку отбирали верхний эфирный слой. В газовый хроматограф вводили 5...10 мкл эфирного экстракта. Идентификацию пиков на полученных хроматограммах проводили путем сравнения времен удерживания стандартной смеси летучих кислот и исследуемых смесей. 4.2.Анализ нелетучих жирных кислот культуральной среды В продуктах метаболизма определяли следующие нелетучие кислоты: молочная щавелевоуксусная щавелевая метилмалоновая малоновая фумаровая янтарная пировиноградная фенилуксусная фенилпропионовая Нелетучие жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров. Для получения метиловых эфиров нелетучих жирных кислот в пробирку отбирали 1 мл культуральной жидкости, добавляли 0,4 мл 50% H2SO4 и 2 мл метанола. Пробирки герметично закрывали и нагревали 30 минут при 60° С. После охлаждения в пробу добавляли 1 мл воды и 0,5 мл хлороформа. Смесь энергично встряхивали. Для хорошего разделения слоев пробы центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. В чистую пробирку отбирали нижний слой хлороформа, добавляли внутренний стандарт / раствор метилового эфира ундекановой кислоты/. Пробу упаривали до объема 100 мкл. В испаритель хроматографа вводили 5...10 мкл пробы. Для идентификации метиловых эфиров нелетучих жирных кислот в культуральных жидкостях их времена удерживания сравнивали с временами удерживания компонентов стандартной смеси. 4.3. Анализ исследуемого биологического материала на содержание ЛЖК Полученный материал тщательно гомогенизировали (1 мл пробы). При необходимости добавляли 1 мл физиологического раствора и центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин . РН супернатанта доводили 50% серной кислотой до 2,0, проводили экстракцию эфиром - 2 раза по 1 мл. Полученный эфирный экстракт упаривали до 100 мкл и вводили непосредственно в хроматограф в количестве 1 мкл. Идентификацию ЛЖК осуществляли по относительному времени удерживания, для сравнения использовали аналитические стандарты жирных кислот. Количественное содержание ЛЖК устанавливали при сравнении высот пиков на хроматограммах пробы и стандартного раствора с известной (0,4мкмоль/мл) концентрацией аутентичных кислот. Для полной достоверности количественных результатов стандартный раствор хроматографировали перед каждой серией анализов, выполняемых последовательно при установившемся режиме работы прибора. При исследовании клинического материала содержание кислот в пробе определяли до 0,0001 мкмоль/мл. С целью учета полноты перехода кислот из водной фазы в эфирную сравнивали хроматограммы эфирного раствора концентрации 0,4 мкмоль/мл и эфирного экстракта из 1мл водного раствора той же концентрации. Установлено, что ЛЖК переходят из водной фазы в эфирную не полностью, поэтому введены поправочные коэффициенты (К), для установления истинного содержания кислот в образце: К- для уксусной кислоты (С 2) -8 ; для пропионовой (С 3) , изомасляной (iC4),масляной(C4), изовалериановой (iC5)- 1,5; для валериановой (С5), изокапроновой (iC6),капроновой (С6) -1. Материал обработан с помощью статистического пакета STATgraphics Vers 4. 5.ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 5.1. Культуральные среды. В контрольных образцах пептонно-дрожжевой среды обнаружены уксусная ( до 10мкг/мл) и янтарная ( до 20 мкг/мл) кислоты. Летучие и нелетучие кислоты, производимые различными видами анаэробных микроорганизмов, представлены в табл.3. В настоящих методических рекомендациях мы приводим также данные, полученные нами ранее, по образованию летучих кислот и аминов у клостридий в случае их роста на бульоне Вейнберга. В табл.4 представлены результаты хроматографического анализа, отражающие видовую специфичность клостридий в продуцировании кислот и аминов. Таблица 3 Состав основных кислотных компонентов в культуральных жидкостях после роста анаэробных микроорганизмов на пептонно-дрожжевой среде Вид Основные летучие кислоты Основные нелетучие кислоты Вacteroides fragilis 323, A,P,IV S,L,PY Bacteroides intermedius,25611 P,A,IV S,L,PY Bacteroides ovatus,8483 A,P,IV S,PhA,L Bacteroides asaccharolyticus,9337 B,IV,P S,L Bacteroides melaningenicus,1011 P,A,IV S,L,M Bacteroides bivius,6318 P,A,IV S,L Bactreroides vulgatus,8482 P,A,IV S,PY,QA Bacteroides tretaiotaomicron,10582 A,P,IV S,L,PA Clostridium perfringens,28 A B,A S,L Clostridium histoliticum139 A S Clostridium novyi,66 A B,HCA,P S,HCA Clostridium septicum IV,B,PA S,L,PA Propionbacterium acnes,70 P,A S,M,Q Fusobacterium nucleatum,143 A,B S,QA,L Fusobacterium necrophorum 22 A,B,P S,QA Peptostreptococcus spp.172/174, IC,HCA,IV HCA,S,L Bifidobacterium adcfescenti A L Lactobacillus auid A L Veillionella parvula А,P Пептонно-дрожжевая среда А S Обозначения кислот: A - уксусная P-пропионовая QA -щавелевоуксусная IV - изовалериановая V -валериановая IC - изокапроновая Q - щавелевая B- масляная PY - пировиноградная PhA - фенилуксусная S - янтарная M - малоновая YCA - гидрокоричная/фенилпропионовая Компоненты в таблице перечислены в порядке уменьшения их содержания. На рис.2 приведены хроматограммы летучих кислот и метиловых эфиров нелетучих кислот, обнаруженных в культуральных жидкостях после роста Вacteroides fragilis 323. Рис.2 Таблица 4 Состав основных летучих кислот и аминов в культуральных жидкостях эталонных видов клостридий, выращенных на бульоне Вейнберга Вид Основные летучие кислоты основные амины Clostridium perfringens, B,P,A Ph,His,Cad Clostridium histoliticum, A,B,P Put,Cad,His Clostridium oedematies ,B,P,A Ph,Cad Clostridium septicum B,A,IV Cad,Put,His Clostridium sordelli HCA,IC,B Clstridium difficille IC,B,P Обозначения кислот приведены в табл.3 Обозначения аминов: Cad - кадаверин,Put - путресцин,Нis - гистидин,Ph - фенилэтиламин Компоненты в таблице перечислены в порядке уменьшения их содержания 5.2. Биологический материал от пациентов При обнаружении гнойно- воспалительного процесса у детей следует сравнить результаты исследования патологического материала с данными табл.5. Таблица 5. Фоновые концентрации ЛЖК (мкмоль/мл) в биологических средах у детей, не имеющих гнойно-воспалительных очагов Анализируемый материал A P B, IB, V, IV, C, IC Трахео-бронхиальный экссудат 0 0 0 Венозная кровь < 0,5 < 0,03 0 Жидкость из брюшной полости < 1,0 < 0,03 < 0,03 Моча < 1,0 < 0,05 < 0,05 Обозначения кислот: A - уксусная P-пропионовая B- масляная IB- изомасляная V -валериановая IV - изовалериановая С-капроновая IC - изокапроновая Повышение содержания ЛЖК в биологическом материале выше фоновых значений свидетельствует о развитии инфекции с участием анаэробов. Возрастание концентрации метаболитов анаэробных бактерий в биологическом материале выше фоновых значений у детей, поступивших с подозрением на острый аппендицит, свидетельствует о гнойном процессе в брюшной полости. Дополнительно подтверждающим фактором является обнаружение ЛЖК в сыворотке крови, наряду с уксусной и пропионовой кислотами. Показано, что при гангренозном аппендиците уровни ЛЖК в биологических средах были существенно выше, чем при флегмонозном аппендиците; для A,P,B,C -в среднем в 2-3 раза, для IV, V в 6-26 раз. Данный метод рекомендуется для косвенной диагностики анаэробной инфекции у новорожденных, находящихся на исскуственной вентиляции легких. Данные обследования /264 пациента/ показали повышенные концентрации пропионовой, изомасляной, масляной и изовалериановой кислот в трахеобронхиальном экссудате больных детей. При лечении меронидазолом выявлено статистически достоверное снижение уровня этих кислот. На рис.3 приведены хроматограммы ЛЖК в смыве из трахеобронхиального дерева ребенка Д.(6 дней жизни) с пневманией на ИВЛ и ребенка К.(7дней жизни) без пневмании. Рис.3 Анаэробные бактерии принимают активное участие в развитии воспалительного процесса мочевыводящих путей у урологических больных, о чем свидетельствует повышение ЛЖК в биологических средах у детей выше фоновых концентраций с обострением хронического пиелонефрита. При этом, метаболиты анаэробных бактерий появляются раньше, чем некоторые лабораторные (лейкоцитоз, СОЭ, лейкоцетурия) признаки. В развитии острого гематогенного остеомиелита у детей, наряду с золотистым стафилококком может принимать участие и анаэробная флора, так как в 50% случаев ЛЖК выше фоновых обнаружены в очаге воспаления и в 60% - в моче. По уровню метаболитов анаэробных бактерий можно контролировать эффективность проводимой терапии, так как стойкое снижение ЛЖК до фоновых концентраций, свидетельствует о подавлении бактериальной активности. ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА Ориентировочный перечень отделений и групп больных, где возможно эффективное использование предложенного экспресс-метода ГЖХ-диагностики анаэробной инфекции, приведен в табл.6. Таблица 6 Перечень отделений и патологий, при которых рекомендован ГХ-метод анаэробной инфекции Отделения Заболевания Отделения интенсивной терапии новорожденных Асфиксия, мекониальная аспирация Аспирационная пневмония на ИВЛ Сепсис Хирургические отделения Раневая неклостридиальная и клостридиальная инфекция Перитониты, абсцессы брюшной полости и забрюшинного пространства Паранефрит, абсцессы почек Абсцессы печени Хронический остеомиелит Хронические воспалительные процессы легких и плевры Отделения гематологии и онкологии Гипертермия неясной этиологии Сепсис, гнойно-воспалительные очаги Отделения акушерства и гинекологии Эндометрит, послеродовой сепсис Отделения неврологии нейрохирургии Абсцессы мозга Забор материала у больных перечисленных групп осуществляется до начала антибактериальной терапии или в течение первых суток от момента ее применения. Последующий контроль эффективности антибактериальной терапии осуществляется через 3-5 суток. В тяжелых случаях число исследований определяется лечащим врачом. Применение адекватной антибактериальной терапии приводит к снижению содержания ЛЖК в биологических жидкостях до фоновых концентраций. Противопоказаний к применению метода не наблюдалось. Ожидаемый эффект от внедрениЯ Определение метаболитов анаэробов в биологических средах у детей, можно использовать для лабораторной диагностики хирургических инфекций, протекающих с участием анаэробной микрофлоры. Преимущество ГЖХ-метода анализа заключается в скорости ответа (от момента взятия сыворотки крови 0,5-1,0 часа, включая и организационные расходы времени), специфичности и высокой чувствительности. Клиническое внедрение метода в отделениях детской онкогематологии позволило в течение двух лет снизить летальность от осложнений, вызванных анаэробами в 2,7 раза. Показано, что диагностическая значимость метода у детей выше, чем у традиционных методов исследования. Своевременная терапия значительно улучшает прогноз заболевания и сокращает сроки лечения. Метод позволяет использовать менее токсичные препараты благодаря возможности контролировать эффективность терапии. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Об унификации микробиологических /бактериологических/ методов исследования, применяяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. - Приказ N 535 от 22.04.1985 г. Минздрав СССР, Москва, 1989 г. 2. Мitruka B.M.// Gas cyromatographic applications in microbiology and medicine. N.Y.,-1975 г. 3. Holdeman L.V., Moore W.E.C. Anaerobe Laboratory Manual. // Blacksburg, Virginia Polytec. Ins. and State Univ. Anaerobe Lab. 1972. 4. Шимчук Л.Ф., Демина А.М. Идентификация анаэробных спорообразующих бактерий, выделенных от больных. Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов// Сб. научных трудов, ГИСК им.Л.А. Тарасевича,М.,1989,с.15-21. 5. Методические рекомендации по использованию хроматографических методов для диагностики газовой гангрены. - ВНИИ БП, Москва, 1990 г. 6. Быченко Б.Д., Каплунова О.П., Кудрина Д.С. Дифференциация основных видов клостридий методом газовой хроматографии. // ЖМЭИ.- 1985, № 10.- С. 22-25. 7.Шимкевич Л.Л., Истратов В.Г.Использовапние газожидкостной хроматографии для изучения клостридиальной анаэробной инфекции в хирургической клинике.//Лаб.дело,-1985,№ 4,с.225-227. 8. Shan H.N., Collins G. //J. Appl.Bacteriology.-1983.-V.55-№ 3.-P.403-416. 9.Meena Kudav et al. // Ind.J.Clud.Res.-1983.-V.77-P.24-28 10. Smith Doug.// Abstr.Ann.Meet.Amer.Soc.Microbiol.,-1987.-87th Ann. Meet., Atlanta, Ga, 1-6 March,1987.-Washington,D.C.-1987.-P.244 11. Uchida //Agr.Biol.Chem.-1975.-V.39,№ 4.-P.837-842. 12. Moss C.W. // J.Clin.Microbiol.-1977.-V.5,№ 6.-P.665-667. 13. Luderitz O.//New Acad.Press.-1971.-V.4,-P.145-161. 14.Васильева А.В.//Биохимия и иммунология микробных полисахаридов.-Томск,-1984. 15.Dahlen G. Ericsson I.//J.Clin.Microbiol.-1983.-V.129,№ 3.-P/557-563. 16. Отчет по этапу 1 договора ГосНИИ БП- ДЦГКБ им Н.Ф.Филатова № 20-92/17. Систематизация и обобщение данных по анаэробной и грибковой инфекции. Выбор перспективных классов маркерных соединений. - ВНИИ БП, Москва, 1992 г. 17.Brooks J.B.,Moss C.W., Dowell V.R.// J.Bacteriol.-1969.-V.100,№ 1.-P.528-530/ 18.Brooks J.B.,Moore W.E.C.//Canad. J. Microbiol.-1969.-V.15.-P1433-1446. 19.Титкова Н.Ф.,Сергеева Т.И.,Бабайцева В.А.,Чирикова Е.В. Заявка N 4915050/14 “Способ дифференциальной диагностики ведущих возбудителей газовой гангрены”. 20. Осипов Г.А., Истратов В.Г., Шабанова Е.А., Сергеева Т.И., Недорезова Т.П., Ходорковская В.А., Бабайцева В.А., Чирикова Е.В. Патент № 2021608 “Способ диагностики клостридиальной анаэробной газовой инфекции”. 21.Aluyi H.S. //Y.Applied Bacteriology.-1983.-V.54.-P.391-397. 22. Pritchard D.C. // Y.Clin. Microbiol.-1981.-V.13.-P. 89-91.