Интенсивная терапия новорожденных

Структура и метаболизм эндогенного сурфактанта.

И.В.Сафонов

1. История открытия сурфактанта.

В 1929 году von Neergard отметил, что для раздувания лёгких собак, заполненных физиологическим раствором, требуется гораздо меньшее давление, чем для лёгких, заполненных воздухом, и заключил, что силы поверхностного натяжения играют важную роль в процессе нормального вдоха. В 1947 году Grunewald заметил, что лёгкие детей, умерших, как он называл, "от ателектазов", также лучше раздуваются, будучи заполненными физиологическим раствором. Он также показал, что введение в дыхательные пути таких лёгких поверхностно-активного вещества амилацетата уменьшает давление, необходимое для раздувания их воздухом. "Сопротивление аэрации является следствием поверхностного натяжения, которое противодействует поступлению воздуха, но не оказывает воздействия на аспирацию жидкости. Поверхностно-активные вещества уменьшают давление, необходимое для аэрации. Это доказывает, что добавление поверхностно-активных веществ к воздуху или кислороду при спонтанном дыхании или вводимому респиратором может помочь в разрешении первичных ателектазов у новорожденных детей".

В 1955 году Radford, основываясь на работе Pattle неверно предположил, что поверхностное натяжение в альвеолах близко к таковому у плазмы (~60 mN). Clements заметил противоречие между тем очень большим транспульмональным давлением, которое следовало бы приложить для раздувания большой поверхности лёгких, если бы величина поверхностного натяжения составляла бы 60 mN, и тем низким транспульмональным давлением, которое на деле требуется для раздувания нормальных лёгких. Он выдвинул гипотезу, что лёгкие синтезируют вещество, уменьшающее силы поверхностного натяжения в альвеолах. В 1956 году он выделил вещество, которое мы сейчас называем сурфактантом и исследовал роль сил поверхностного натяжения в поддержании стабильности альвеол.

В 1959 году Avery и Mead первыми доказали недостаточность сурфактанта у детей, умерших от РДС. Они отметили, что силы поверхностного натяжения в лёгких детей, умерших от болезни гиалиновых мембран, были гораздо выше, чем у детей, умерших от других причин, и установили обратную зависимость между этими силами и гестационным возрастом ребёнка.

2. Структура и метаболизм сурфактанта.

Основу развития РДС у новорожденных детей составляет структурно-функциональная незрелость лёгких и системы сурфактанта. Сурфактант представляет собой мономолекулярный слой на поверхности раздела между эпителием альвеол и воздухом.

В 1961 году Pattle и Thomas, Buckingham и группа Clements определили, что сурфактант является липопротеином. Слой сурфактанта состоит на 90% из липидов, преимущественно фосфолипидов. Главными фосфолипидами являются фосфатидилхолин (ФХ) - 25%, дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) - 45%, который впервые был идентифицирован Clements, и фосфатидилглицерол - 5%. Также в состав фосфолипидной фракции входят фосфатидилинозит, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин (всего 5%). К липидам сурфактанта относятся холестерин, триглицериды, ненасыщенные жирные кислоты, сфигномиелин (10%). Оставшиеся 10% приходятся на долю белковой фракции сурфактанта, которая представлена белками-апопротеинами, среди которых выделяют SP-A, SP-B и SP-C. Важная роль протеинов была впервые установлена King и Clements в 1972 году, в настоящее время не вызывает сомнения.

Сурфактант синтезируется альвеолоцитами 2-го типа, которые развиваются из кубовидного эпителия дистального отдела дыхательных путей с 25-26 недели гестации. Липиды сурфактанта синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме микросомальной фракции альвеолоцитов 2-го типа и транспортируются через комплекс Гольджи и пластинчатые тельца в просвет альвеол. Сурфактант существует в различных физических формах. Липиды сурфактанта первоначально секретируются как пластинчатые тельца, которые затем "распутываются" в тубулярный миелин перед секрецией и поверхностной адсорбцией в виде монослоя липидов и протеинов сурфактанта на границе раздела воздух-жидкость. Молекулы ФХ синтезируются преимущественно по цитидил-трифосфатному пути, и этот процесс регулируется такими ферментами, как фосфорилхолинцитидилтрансфераза и холинфосфотрансфераза. Протеины сурфактанта гликозилируются в аппарате Гольджи и перемещаются в пластинчатые тельца, где соединяются с фосфолипидами. Представляется, что компоненты сурфактанта вместе секретируются из пластинчатых телец в просвет альвеол, хотя у недоношенных ягнят скорость секреции SP-A намного выше, чем ФХ. Секреция происходит путём экзоцитоза. Процесс секреции контролируют несколько факторов. Адреномиметики напрямую воздействуют на рецепторы альвеолоцитов 2-го типа, повышая уровень цАМФ, который, по-видимому, стимулирует секрецию сурфактанта, в то время как агонисты холинэргических рецепторов, такие как пилокарпин, стимулируют секрецию сурфактанта опосредованно через стимуляцию освобождения адренэргических агонистов. Было показано, что и простагландины увеличивают секрецию фосфатидилхолина как напрямую, так и опосредованно. Наконец механические факторы, такие как раздувание лёгких и гипервентиляция, могут приводить к секреции сурфактанта.

Основной путь клиренса сурфактанта это его захват альвеолоцитами 2-го типа. Во взрослых лёгких примерно 50% сурфактанта перерабатывается макрофагами и в лизосомах альвеолоцитов 2-го типа. Оставшиеся 50% повторно поступают в пластинчатые тельца для ресекреции. При внутривенном введении меченного сурфактанта происходит активный круговорот фосфолипидов между пластинчатыми тельцами и сурфактантом в просвете альвеол. 80-90% фосфолипидов могут оставаться интактными в течение этого процесса и могут рециркулировать и повторно использоваться в течение нескольких дней. Существует мнение, что введение больших доз экзогенных фосфолипидов детям и взрослым с РДС может изменять процессы обратного захвата и клиренса, хотя в исследованиях на животных введение экзогенного сурфактанта не приводило к колебаниям в этом процессе.

Как только ФХ вступил в цикл синтеза, секреции и круговорота, он остаётся в лёгких длительный период времени. Так у новорожденных ягнят биологическое время полужизни ФХ составило 6 дней. В исследованиях время полужизни ДПФХ колебалось от 20 до 80 часов в зависимости от места размещения метки (в пальмитате, холине или фосфатидиле соответственно, что отражает различные метаболические пути разных частей молекулы). Период полужизни у взрослых животных был короче, чем у новорожденных.

У доношенных новорожденных кроликов круговорот сурфактанта начинается немедленно после рождения. Полное время обращения альвеолярного ФХ составляет 10 часов и эффективность круговорота превышает 90%. Таким образом, несмотря на метаболическую активность сурфактантного "пула" вклад в него синтеза сурфактанта de novo невелик. Кинетика встраивания нового ФХ в альвеолярный "пул" медленная, и если количество сурфактанта первоначально мало или альвеолярный "пул" истощён, синтез de novo не в состоянии быстро его восстановить. Согласно исследованиям, проведённым на недоношенных ягнятах с гестационным возрастом 138 дней при полном сроке беременности 150 дней не было отмечено различий в путях метаболизма ФХ по сравнению с доношенными животными.

Метаболизм протеинов сурфактанта несколько отличается от такового для ФХ у недоношенных животных. Так, эндогенно синтезированный SP-A быстро секретируется в просвет альвеол после рождения, хотя секреция ФХ начинается только спустя 5 часов после родов. Вскоре после рождения пластинчатые тельца уже не содержат SP-A, таким образом, начальная секреция этого протеина происходит по независимым от ФХ путям. Меченый SP-A исчезал из просвета альвеол гораздо быстрее, чем фосфатидилхолин, опять таки показывая различия в путях клиренса этих различных компонентов сурфактанта. О путях метаболизма протеинов SP-B и SP-C пока известно немного.

Количество протеинов SP-A, SP-B и SP-C возрастает в процессе гестации, эти изменения идут параллельно с возрастанием липидных компонентов. Так изменения количества SP-A в амниотической жидкости происходят вместе с изменением количества ФХ.

Примерно с 20 недель гестации плод аккумулирует сурфактант в пластинчатых тельцах примитивных альвеолоцитов 2-го типа. До наступления периода доношенности наблюдается прогрессивное увеличение количества альвеолоцитов 2-го типа, увеличение в них количества пластинчатых телец и повышение содержания сурфактанта в амниотической жидкости. Аккумуляция ФХ в лёгочной ткани протекает линейно, начиная с 20 недель и до периода доношенности. При нормальной беременности достоверная секреция сурфактанта в амниотическую жидкость как отражение его аккумуляции не происходит вплоть до 35 недели гестации. У доношенного ребёнка в амниотической жидкостиприсутствует большое количество сурфактанта, показывая большие запасы его в легких плода.

Используя метод лаважа ТБД с физиологическим раствором, Adams (1970) определил, что количество натурального сурфактанта у детей с РДС составляет 1-10 (в среднем 5) мг/кг. Hallman (1986) использовал для измерения количества натурального сурфактанта изменения в его составе после лечения. Он использовал определённое количество сурфактанта, содержащего фосфатидилглицерол, который не содержится в естественном сурфактанте, и использовал для подсчёта по методике Фика процентное соотношение фосфатидилглицерола в пробах, взятых из дыхательных путей. В исследовании среднее количество эндогенного сурфактанта у ребёнка с РДС весом более 1 кг составило 9 мг/кг. В тоже время исследования, проведённые на доношенных животных показали, что у них содержание сурфактанта составляет около 100 мг/кг. У взрослых животных количество эндогенного сурфактанта, определённое путём лаважа ТБД, составляет 5-15 мг/кг. Так что утверждение, что у недоношенного ребёнка имеется дефицит сурфактанта условно. Недоношенный имеет гораздо меньше сурфактанта, чем доношенный ребёнок, хотя его количество сопоставимо с таким у взрослого. Предположение, что введение экзогенного сурфактанта восполняет его недостаток в незрелых лёгких применимо относительно только доношенного ребёнка.

Представляет большой интерес, как изменяется "пул" сурфактанта у ребёнка с РДС после рождения. К сожалению, нет надёжных методик для оценки этого процесса. Процедура лаважа ТБД не даёт точных значений. Hallman (1991) предложил использовать не абсолютные значения количества сурфактанта, а его концентрацию в дыхательных путях путём расчётов на основе определения мочевины и фосфатидилхолина в пробах. Так как содержание мочевины в плазме и секрете дыхательных путей идентично, её определение призвано оценить истинный объём забранной жидкости. Концентрацию сурфактанта в дыхательных путях трудно оценить количественно, поэтому важнее проследить динамику её изменения. У детей с РДС концентрация сурфактанта медленно повышается в течение первых и вторых суток жизни, затем быстро повышается до уровней, аналогичных детям, пролеченным сурфактантом или не имевшим РДС. У недоношенных ягнят наблюдается очень медленное его повышение в первые 24 часа. У недоношенных обезьян наблюдается почти 10-кратное увеличение "пула" сурфактанта с 1-го по 4-5 день жизни. Скорость прироста количества сурфактанта после 3-4 суток жизни составляет 0,5 мг/кг/час. Малое количество эндогенного сурфактанта при рождении с последующим увеличением после 2-3 дня жизни соотносится с наблюдениями, что у недоношенных ягнят пути синтеза и секреции сурфактанта остаются неизменёнными, но относительно мало сурфактанта синтезируется de novo. Другое важное заключение из этой информации заключается в том, что через несколько дней после рождения дети с РДС вряд ли имеют первичный дефицит сурфактанта.

Для оценки изменений в метаболизме и количестве сурфактанта при лечении экзогенным сурфактантом исследовали недоношенных ягнят с гестационным возрастом 132 дня. Такие животные, как правило, развивают тяжёлый респираторный дистресс и погибают в течение 5 часов, несмотря на вентиляционную поддержку. При применении 100 мг/кг натурального животного сурфактанта удавалось легко поддерживать жизнь в течение 24 часов, используя умеренные параметры ИВЛ с концентрацией кислорода во вдыхаемой газовой смеси 50%. Практически не отмечено потерь меченного фосфатидилхолина из лёгких, что отражает крайне малую активность катаболизма сурфактанта. Введённый препарат очень быстро "встраивался" в лёгочную ткань, при лаваже удавалось получить не более 40% введённого ФХ и эта цифра практически не изменялась в течение 24 часов. Альвеолярный "пул" сурфактанта после лечения возрастал с примерно 5 мкмоль/кг до 20-30 мкмоль/кг. Используя введение меченного лизофосфатидилхолина (первичного продукта катаболизма фосфатидилхолина, который быстро поглощается лёгочной тканью и на 30% конвертируется в фосфатидилхолин и ресекретируется) и пальмитиновой кислоты для оценки эндогенного синтеза сурфактанта не было отмечено изменений во "встраивании" предшественников в фосфатидилхолин или в секреции эндогенно синтезированного сурфактанта после введения 100 мг/кг натурального сурфактанта. Более того, введение экзогенного сурфактанта может улучшать метаболизм фосфолипидов.

Таким образом, можно заключить, что недоношенные животные с дефицитом сурфактанта, по-видимому, имеют все необходимые пути для синтеза и секреции фосфатидилхолина. Скорость синтеза и кинетика секреции сравнимы как у недоношенных, так и у доношенных животных. Процессы круговорота также активны при всех гестационных возрастах и используемый для лечения экзогенный сурфактант встраивается в механизмы круговорота. Круговорот способен эффективно поддерживать функцию сурфактанта. Лечение экзогенным сурфактантом не оказывает побочного влияния на эндогенный синтез и секрецию сурфактанта по принципу обратной связи.

Как эндогенный, так и экзогенный сурфактант может инактивироваться из-за пропотевания белков в просвет альвеол, например при отёке лёгких, что диктует необходимость лечения большими дозами и неоднократными введениями сурфактанта. Хотя в своей работе Griese и Westerburg (1998) не отметили корреляции между количеством белка в альвеолах и величиной сил поверхностного натяжения или индексом оксигенации как у детей, лечившихся экзогенным сурфактантом, так и в группе детей с нетяжёлым РДС, не получавшими сурфактант. Исходя из этого они заключили, что ингибирование сурфактанта белками, пропотевающими в просвет альвеол, не играет существенной роли в процессе выздоровления детей с РДС. В то же время сурфактант может активироваться в лёгких. Так, свойства синтетического сурфактанта могут быть улучшены добавлением апопротеинов SP-B и SP-C. Функцию сурфактанта может улучшить его предварительная инстилляция в здоровые взрослые лёгкие, а также введение синтетического сурфактанта в незрелые лёгкие ягнят. Таким образом экзогенный сурфактант как активируется, так и ингибируется в лёгких и суммарный эффект зависит от баланса этих разнонаправленных факторов.

3. Функции сурфактанта.

Основной ролью сурфактанта является снижение сил поверхностного натяжения в альвеолах, что приводит к их стабилизации и препятствует экспираторному коллапсу. Добавление альбумина или фибриногена снижает этот эффект. Кроме этого сурфактант обладает рядом других полезных свойств. Сурфактант тормозит формирование отёка лёгких в связи с тем, что, обладая свойствами снижать поверхностное натяжение, он повышает интерстициальное гидростатическое давление, тем самым уменьшая трансмуральный гидростатический градиент давления в микрососудистом русле альвеол. Натуральный сурфактант способен препятствовать накоплению жидкости в просвете мелких дыхательных путей, не позволяя уменьшаться их просвету. Сурфактант способен изменять свойства мокроты. У детей с РДС, пролеченных сурфактантом по сравнению с плацебо-леченными детьми мокрота была менее плотная и менее вязкая, содержала больше воды и тем самым была более "транспортабельна". Возможно сурфактант эмульгирует комочки мокроты, препятствуя агломерации и уменьшая адгезию. В экспериментах на свиньях было показано, что у животных, которым вводился экзогенный сурфактант, был повышен мукоцилиарный транспорт. На модели нормального трахеального эпителия сурфактант привёл к небольшому (менее 10%) увеличению частоты биения ворсинок в дозо-зависимом режиме. На эпителии, повреждённом перекисью водорода, быстрее восстанавливалось движение ворсинок при применении сурфактанта. Сурфактант уменьшает поверхностное натяжение слизистого слоя центральных дыхательныхпутей, что также может улучшить мукоцилиарный транспорт.

Сурфактант играет роль в антибактериальной защите лёгких. Липидные компоненты сурфактанта повышают макрофагальную фагоцитарную активность. Сурфактантный протеин A (SP-A) работает как опсонин в фагоцитозе вируса простого герпеса макрофагами. Альвеолярным макрофагам крыс для уничтожения золотистого стафилококка требуется материал альвеолярной стенки. Поверхностно-активные вещества, полученные при лаваже лёгких крыс и человека, улучшают фагоцитоз золотистого стафилококка.

Экзогенный сурфактант может уменьшать воспаление, ингибируя секрецию различных клеточных продуктов, таких как интерлейкины (IL-1 и IL-6) и фактор некроза опухоли (TNF) моноцитами человека.