Проблемы медицинской микологии.-2005.- Т.7, №2.- С.12-16.

Аллергены грибов. Особенности микогенной сенсибилизации (обзор) 

Аак О.В.

НИИ Медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава, Санкт-Петербург, Россия 

За последние 10 лет в связи с развитием методов протеомики и генной инженерии сделан качественный скачок в исследовании аллергенов микромицетов, изучены все этапы поступления аллергенов в организм, предложены механизмы их воздействия на иммунную систему.  Проведены масштабные эпидемиологические исследования, установлена роль микогенной сенсибилизации в патогенезе ряда аллергических заболеваний.

Ключевые слова: аллерген, аллергия, конидии, микромицеты, сенсибилизация, споры,  IgE

Неприхотливость к среде обитания, большое биологическое разнообразие обусловливают как повсеместное распространение, так и изобилие микромицетов в окружающей среде. Содержание биомассы микромицетов в почве, в зависимости от содержания в ней органического субстрата, может достигать сотен граммов на квадратный метр. При этом содержание репродуктивных клеток – спор может колебаться в пределах от 17 до 85 % [1]. Благодаря малым размерам, они с легкостью поступают в биоаэрозоль и переносятся в атмосфере на большие расстояния. Концентрация грибных спор в воздухе может превышать концентрацию пыльцы растений на 2-3 порядка [2].

Человек своей хозяйственной деятельностью создал новые экологические ниши для обитания грибов. Это - «горы» органических отходов на свалках и в производствах, в которых используют грибы в технологическом цикле, а также здания и сооружения различного назначения при неправильной их эксплуатации.

Человек сам, являясь частью биосферы, колонизирован микромицетами, в большинстве случаев входящими в состав нормобиоты. При определенных условиях высокомолекулярные, иммунологически активные, компоненты микроорганизма могут преодолеть защитные барьеры кожи и слизистых оболочек своего хозяина.

Аллергия к грибам известна давно. Так,  сенная лихорадка была подробно описана  в 1819 г. [3], в 1873 г. была показана роль микромицетов в ее этиологии [4].  В настоящее время многочисленными исследованиями доказано значение микогенной сенсибилизации в патогенезе аллергического ринита, бронхиальной астмы, аллергических бронхолегочных микозов, экзогенного аллергического альвеолита, атопического дерматита [5-11]. Эпидемиологическими исследованиями показано, что уровень микогенной сенсибилизации весьма значителен и колеблется в зависимости от генетических особенностей обследованных групп населения и климато-географических особенностей их мест обитания  - от 5% (юг Европы) до 40% (Портленд, США) для больных бронхиальной астмой [7]. А в условиях пустыни (Кувейт) среди обследованных астматиков был «достигнут» показатель  в 46% [12].

В марте 2005 г. общее  количество зарегистрированных аллергенов, список которых размещен на сайте www.allergen.org,  достигло 489, по данным подкомитета по номенклатуре аллергенов Международного союза иммунологических обществ (IUIS). Из них 86 – аллергены грибов (табл. 1).

Таблица 1

Перечень грибковых аллергенов

Следует напомнить, что в 1994 г., когда была введена новая  номенклатура (три первых буквы – сокращение названия рода, через пробел - одна или две буквы – сокращение названия вида, через пробел – порядковый номер), в списке 104 известных аллергенов были указаны  лишь 6 грибных. Опережающий темп исследований микоаллергенов объясняют, в первую очередь, большим разнообразием гликопротеинов – аллергенов в составе грибной клетки. Так,  некоторые штаммы микромицетов могут синтезировать до 40 отдельных макромолекул, связывающих IgE [4]. Наиболее хорошо изучен Aspergillus fumigatus, для которого охарактеризовано 19 аллергенов (табл. 2). А подавляющее количество зарегистрированных аллергенов принадлежит всего 5 родам – Aspergillus,  Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Malassezia, в то время как с симптомами аллергии дыхательных путей связывают около 80 родов грибов [2], а на рынке экстрактов аллергенов США можно обнаружить 75 видов микромицетов, относящихся к 35 родам [13].  Очевиден приоритетный подход к изучению наиболее значимых и распространенных сенсибилизирующих агентов из грибов.

Таблица 2       

Аллергены Aspergillus fumigatus

В упомянутом выше списке аллергенов во многих случаях приводят их биологическую функцию, в том числе  - ферментативную активность. При сравнении спектра ферментов, относимых к группе  ингаляционных аллергенов,  удивляет отсутствие протеаз среди растительных аллергенов наряду с присутствием, в ряде случаев, ингибиторов этих ферментов.  Протеазами изобилуют аллергены в экскрементах дерматофагоидных клещей; протеаз много и в аллергенах микромицетов.

Исследования о роли протеаз в процессе сенсибилизации макроорганизма, в основном, были посвящены сильным аллергенам дерматофагоидных клещей, в частности, цистеиновой протеазе Der p 1.  С использованием монослоев клеток легочного эпителия человека и флуоресцентно-меченных моноклональных антител к различным трансмембранным белкам были найдены молекулы-мишени протеаз в местах плотного клеточного контакта [14-16]. Ими оказались окклудин,  клаудины и белок ZO-1, обеспечивающие в норме непроницаемость барьеров в местах тесного контакта клеток. Частичный протеолиз этих белков вызывал нарушение структуры монослоя и поступление через него аллергенного материала. Сходную картину – десквамацию эпителиальных клеток наблюдали при обработке культур клеток протеазами A. fumigatus; используя различные ингибиторы, авторы установили роль сериновых протеаз в процессе разрушения клеточного слоя [17]. Более того, в ряде работ было показано, что иммунизация лабораторных животных цистеиновыми протеазами Der p 1 и CPB2.8 из Leishmania mexicana усиливала биосинтез общего и специфических IgE, но только при условии парентерального введения ферментов, не ингибированных необратимыми специфическими ингибиторами [18,19]. После иммунизации СРВ2.8 в гомогенатах лимфоузлов значительно повышался уровень ИЛ-4 мРНК и, как следствие, возрастал  уровень биосинтеза цитокина в параллельных опытах с клеточными культурами. В опытах in vitro было установлено, что цистеиновые протеазы способны селективно удалять некоторые клеточные рецепторы, влияющие на баланс Th1/Th2 ответа. В частности, удаляется маркер CD25 -  субъединица высокоаффинного рецептора ИЛ-2, аутокринного фактора пролиферации Th1 лимфоцитов [18] и  маркер CD23 [19], образующий низкоаффинный рецептор IgE, работающий по принципу отрицательной обратной связи. Насколько эти наблюдения описывают процессы, происходящие в организме при микогенной сенсибилизации, покажут дальнейшие исследования. Во всяком случае, установлено, что совместное интраназальное введение мышам ряда содержащих протеазы экстрактов аллергенов, включая грибные, и овальбумина приводит к повышению уровня ИЛ-4, общего IgE и специфических к овальбумину IgG1 [20]. В цитируемой работе выявлены также  межвидовые отличия протеаз A. fumigatus  и A. oryzae. Так, несмотря на большие дозы (в 70 раз в пересчете на протеолитическую активность) аллергена A. oryzae, введение аллергена из  A. fumigatus вызывало более выраженную аллергическую реакцию. Подобного же рода исследование было выполнено при интраназальном введении мышам рекомбинантного аллергена Asp f 2 и высокоочищенного аллергена Asp f 13. При этом иммунизация главным аллергеном A. fumigatus Asp f 2, с которым реагируют более 90% сывороток больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, не вызывала повышения уровня общего IgE и появления специфических реагиновых антител.  При иммунизации смесью аллергенов имело место значительное нарастание уровня общего IgE, и в сыворотке могли быть обнаружены специфические IgE к обоим аллергенам [21]. Сходные, хотя и менее убедительные, результаты были получены при внутрибрюшинной иммунизации мышей экстрактом конидий Penicillium chrysogenum, содержащим сериновые протеазы, в сочетании с интраназальным введением самих конидий [22].

Важным является и выявление эффективности сериновых протеаз, которыми богаты грибковые препараты, в модуляции иммунного ответа. Известно, что сериновые протеазы участвуют в процессе активации комплемента. В 1987 г. было установлено, что различные препараты аллергенов способны вызывать образование компонентов С3а, С4а и С5а [23]. При этом было отмечена наиболее высокая, превосходящая клещевые препараты, активность аллергенов A. fumigatus. В дальнейшем на мышах с различными генетическими дефектами была показана связь образования анафилатоксина С3а и иммунного ответа по Th2 типу [24,25].

Препараты аллергенов представляют собой сложные многокомпонентные смеси. Коммерческие препараты, использующиеся для кожных проб,  как правило, проходят стадию очистки от низкомолекулярных компонентов, возможно, имеющих иммуномодулирующую активность и не тождественных тем природным композициям, с которыми встречается при ингаляционном контакте человек. Проблема тождественности в случае микромицетов также возникает при использовании культуральной жидкости. Вопросы аллергизации макроорганизма было бы более корректно изучать, используя экстракты конидий.

Из вышеизложенного следует, что аллергены грибов, обладающие протеолитической активностью, так же как и протеазы дерматофагоидных клещей, являются завершенными аллергенами, самостоятельно преодолевающими защитные барьеры организма. Термин «завершенный» означает способность аллергена к  преодолению иммунологической толерантности, к  распознанию его (аллергена) иммунокомпетентными клетками с последующей выработкой специфичных реагиновых антител и к индукции (за счет поливалентности при повторном контакте) выброса медиаторов аллергической реакции.  В этой связи следует указать на различие грибных и растительных аллергенов. Выше уже упоминалось об отсутствии протеаз  среди известных растительных аллергенов. В то же время известно о высокой протеолитической активности пыльцевых растительных экстрактов [20]. Очевидно, они (неидентифицированные протеазы) имеются в составе этих экстрактов и, предположительно, обеспечивают транспортную и адъювантную функции, но не являются аллергенами. Ответ на вопрос, почему некоторые белки являются аллергенами, а другие нет, является важным как сам по себе, так и с точки зрения оценки безопасности продуктов генетической инженерии и конструирования аллерговакцин [26]. Решение этого вопроса пытаются найти как при детальном изучении отдельных аллергенов, так и при обобщении полученных результатов на основе компьютерного анализа структур молекул [27]. В последние годы методами иммунологического   продуктов  коротких пептидных фрагментов молекулы аллергена  выявляют линейные эпитопы, ответственные за связывание с антителами и лимфоцитами. Затем путем направленного мутагенеза определяют аминокислотные остатки, необходимые для биологической активности аллергена [28-31]. В результате в банках данных структуры белков в настоящее время находятся модели 35 аллергенов, полученных из данных рентгеноструктурного анализа, в том числе 2 грибных аллергена – Asp f 1 и Asp f 6 (из  A.fumigatus). Описаны эпитопы 23 аллергенов, в том числе 6 грибковых – Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3 , Asp f 13, Alt a 1 (из Alternaria alternatа), Pen ch 18 (из Penicillium chrysogenum). Предпринимают попытки выявления общих структурных черт, присущих аллергену как таковому [32].

Для понимания особенностей микогенной сенсибилизации не следует упускать из вида и форму, в которой аллергены попадают в дыхательные пути. Ингаляционные аллергены растений и грибов, в отличие от бытовых или эпидермальных, присутствуют в аэрозолях, в основном, в инкапсулированной форме. Это - пыльца трав и деревьев, споры/конидии грибов. Исключения возникают после дождя, когда возможен выброс содержимого набухших пыльцевых зерен в виде субмикроскопических частиц [33] и в случаях техногенных выбросов. Конидии  имеют размер, в среднем, на порядок меньший, чем пыльцевые зерна. Диаметр конидий микромицетов таких распространенных родов, как Penicillium и Aspergillus, не превышает 3-5 мкм. Исключением является Alternaria с ее крупными макроконидиями, которые, однако, могут присутствовать в аэрозолях в сегментированном виде. В опытах на хомячках с использованием электронной микроскопии [34] было показано, что базидиоспоры Calvatia excipuliformis, имеющие диаметр 3,5 мкм и поэтому являющиеся хорошей моделью для большинства грибных конидий, достигают в массе от 70 до 90% альвеол легких. Через 30 мин после ингаляции до 22% спор были фагоцитированы макрофагами в надальвеолярных отделах дыхательных путей. У легочных макрофагов антиген-представляющая функция выражена слабо [35]. Для инициации иммунного ответа споры, заключенные в прочные оболочки, должны успеть выделить в окружающую среду достаточное количество сенсибилизирующего материала до того, как их фагоцитируют макрофаги. Этот материал, содержащий протеазы, должен проникнуть через эпителиальный барьер и достигнуть дендритных клеток и клеток Лангерганса в воздухоносных путях или же дендритных клеток в альвеолярном эпителии. При этом необходимо учесть, что респираторный отдел легких наиболее толерантен за счет малочисленности антиген-представляющих клеток. При массированном поступлении антигенного материала состояние толерантности может быть преодолено с возникновением IgG-опосредованного экзогенного аллергического альвеолита. Что же касается скорости экстракции аллергенного материала из спор, то при исследовании базидиоспор было показано,  что она зависит, в первую очередь, от толщины оболочки [36]. При исследовании влияния проращивания конидий ряда митоспоровых грибов на выделение ими в окружающую среду детектируемых иммунохимически аллергенов, австралийскими авторами было установлено, что мелкие и прочные конидии таких грибов, как A. fumigatus и P. chrysogenum, лишь в незначительной степени выделяют аллергены без длительной предварительной инкубации во влажной среде [37,38].

В заключение необходимо отметить, что, несмотря на ярко выраженную «агрессивность» грибных аллергенов, существуют сдерживающие факторы, позволяющие здоровому организму, как правило, без вреда переносить естественный фон микоаллергенов. В случае же повышения аллергенной нагрузки или при развитии атопических состояний риск микогенной сенсибилизации существенно возрастает.

 ЛИТЕРАТУРА 

1. Елинов Н.П. Микоаллергены //Общая аллергология. Т.1. / Под ред. Г.Б.Федосеева. – СПб: «Нордмед-Издат», 2001.-С.98-113.
2. Horner W.E., Helbling A., Salvaggio J.E., Lehrer S.B. Fungal allergens //Microbiol.Rev.-1995.-Vol.8, №2.- P.161-179.
3. Крякунов К.Н. История аллергологии// Общая аллергология. Т.1. /Под ред. Г.Б.Федосеева. – СПб: «Нордмед-Издат», 2001.-С.19-41.
4. Frew A.J. Mold allergy: Some progress made, more needed //J.Allergy Clin.Immunol.-2004.-Vol.113, №2.-P.216-218.
5. Kurup V.P., Shen H.-D., Vijay H. Immunobiology of fungal allergens //Int.Arch.Allergy Immunol.- 2002.- Vol.129.- P.181-188.
6.  Аак О.В.,  Соболев А.В., Козлова Я.И. Частота  микогенной сенсибилизации, выявляемой серологическим методом у больных аллергозами  // Успехи медицинской микологии. Материалы второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии.- М.-2004.- Том 3.- С.123.
7. Zureik M., Neukirch C., Leynaert B., et al. Sensitisation to airborne moulds and severity of asthma: cross sectional study from European Community respiratory health survey // Brit.Med.J.-2002.-Vol.325.-P.411-414.
8.  Соболев А.В., Аак О.В., Черкашин В.В., Васильева Н.В., Филатов В.С. Микогенная сенсибилизация и её клинические проявления при бронхиальной астме //  International J. on Immunorehabilitation.-2004, Вып. «Физиология и патология иммунной системы».- Т.6, №1.-С. 45.
9. Greenberger P.A. Allergic bronchopulmonary aspergillosis //J.Allergy Clin.Immunol.- 2002.-Vol.110, №5.-P.685-692.
10. Lee S.K., Kim S.S., Nahm D.H., et al. Hypersensitivity pneumonitis caused by Fusarium napiforme in a home environment //Allergy.-2000.-Vol.55.-P.1190-1193.
11. Faergemann J. Atopic dermatitis and fungi //Clin.Microbiol.Rev.-2002.-Vol.15, №4.-P.545-563.
12. Ezeamuzie C.I., Al-Ali S., Khan M., et al. IgE-mediated sensitization to mould allergens among patients with allergic respiratory diseases in a desert environment //Int.Arch.Allergy Immunol.- 2000.-Vol.121.-P.300-307.
13. Esch R.E. Manufacturing and standardizing fungal allergen products // J.Allergy Clin.Immunol.- 2003.-Vol.113, №2.-P.210-215.
14. Robinson C., Baker S.F., Garrod D.R. Peptidase allergens, occluding and claudins. Do their interaction facilitate the development of hypersensitivity reactions at mucosal surfaces? // Clin. Exp. Allergy.-2001.-Vol.31. -P.186-192.
15. Wan H., Winton H.L., Soeller C., et al.  Der p 1 facilitates transepithelial allergen delivery by disruption of tight junctions // J. Clin. Invest. -1999.- Vol.104, №1.-P. 123–133.
16. Wan H., Winton H.L., Soeller C., et al.  Quantitative structural and biochemical analyses of tight junction dynamics following exposure of epithelial cells to house dust mite allergen Der p 1// Clin. Exp. Allergy.-2000.-Vol.30, №5.-P.685-698.
17.  Tomee J.F., Wierenga A.T., Hiemstra P.S., Kauffman H.K. Proteases from Aspergillus fumigatus induce release of proinflammatory cytokines and cell detachment in airway epithelial cell lines.// J. Infect. Dis. – 1997.-Vol.176, №1.-P. 300-303.
18. Gough L., Schulz O., Sewell H.F., Shakib F. The Cysteine protease activity of the major dust mite allergen Der p1 selectively enhances the immunoglobulin E antibody response// J. Exp. Med.- 1999.- Vol.190, №12.-P.1897–1901.
19. Pollock K.G.J., McNeil K.S., Mottram J.C., et al. The Leishmania mexicana cysteine protease, CPB2.8, induces potent Th2 responses.//J. Immunol.- 2003.-Vol.170.-P.1746–1753.
20. Kheradmand F., Kiss A., Xu J., et al.  A protease-activated pathway underlying Th cell type 2 activation and allergic lung disease.// J. Immunol.- 2002.-Vol. 169.-P.5904–5911.
21.   Kurup V., Xia J.-Q., Shen H.-D., et al. Alkaline serine proteinase from Aspergillus fumigatus has synergistic effects on Asp-f-2-induced immune response in mice // Int.Arch.Allergy Immunol.- 2002.-Vol.129.-P.129-137.
22.   Schwab C.J., Cooley J.D., Brasel T., et al. Characterization of exposure to low levels of viable Penicillium chrysogenum conidia and allergic sensitization induced by a protease allergen extract from viable P. chrysogenum conidia in mice // Int.Arch.Allergy Immunol.- 2003.-Vol.130.-P.200-208.
23.   Nagata S., Glovsky M.M. Activation of human serum complement with allergens. I. Generation of C3a, C4a, and C5a and induction of human neutrophil aggregation //J. Allergy Clin. Immunol. -1987.-Vol.80, №1.-Р.24-32.
24. Drouin S.M., Corry D.B., Kildsgaard J., Wetsel R.A. Cutting edge: the absence of C3 demonstrates a role for complement in Th2 effector functions in a murine model of pulmonary allergy. // J. Immunol.- 2001.-Vol.167, №8.-Р.4141-4145.
25. Drouin S.M., Corry D.B., Hollman T.J., et al. Absence of the complement anaphylatoxin C3a receptor suppresses Th2 effector functions in a murine model of pulmonary allergy. // J. Immunol.- 2002, №169.-P.5926-5933.
26. Taylor S.L., Hefle S.L. Will genetically modified foods be allergenic? //J. Allergy Clin. Immunol.-2001.-Vol.107, №5.-P.765-771.
27. Ivanciuc O., Schein C.H., Braun W. Data mining of sequences and 3D structures of allergenic proteins.//Bioinformatics.-2002.-Vol.18, №10.-P.1358-1364.
28. Simon-Nobbe B., Probst G., Kajava A.V., et al.  IgE-binding epitopes of enolases, a class of highly conserved fungal allergens //J.Allergy Clin.Immunol.-2000.-Vol.106, №5.-P.887-895.
29. Shen H.-D., Lin W.-L., Tam M.F., et al.  Identification of vacuolar serine proteinase as a major allergen of Aspergillus fumigatus by immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis //Clin.Exp.Allergy.- 2001.-Vol.31.-P.295-302.
30. Shen H.D., Chou H., Tam M.F., et al. Molecular and immunological characterization of Pen ch 18, the vacuolar serine protease major allergen of Penicillium chrysogenum.// Allergy.-2003.-Vol.58, №10.-P.993-1002.
31. Lai H.Y., Tam M.F., Chou H., et al. Molecular and structural analysis of immunoglobulin E-binding epitopes of Pen ch 13, an alkaline serine protease major allergen from Penicillium chrysogenum.// Clin Exp Allergy.- 2004.- Vol.34, № 12.-P.1926-1933.
32. Aalberse R.C. Structural biology of allergens.// J. Allergy Clin. Immunol.-2000.-Vol.106,  №2.-P.228-238.
33.   Grote M., Vrtala S., Niederberger V., et al. Release of allergen-bearing cytoplasm from hydrated pollen: A mechanism common to a variety of grass (Poaceae) // J. Allergy Clin.Immunol.-2001.-Vol.108, №1.-P.109-115.
34. Geiser M., Leupin N., Maye I., et al. Interaction of fungal spores with the lungs: Distribution and retention of inhaled puffball (Calvatia excipuliformis) // J. Allergy Clin.Immunol.-2000.-Vol.106, №1.-P.92-100.
35. Аллергические болезни. Диагностика и лечение / Под ред. А.Г. Чучалина. - М.: «ГЭОТАР Медицина».-2000.- 733 С.
36.   Horner W.E., Levetin E., Lehrer S.B. Basidiospore allergen release: elution from intact spores.// J. Allergy Clin. Immunol.-1993.-Vol.92, №2.-P.306-312.
37.   Mitakakis T.Z., Barnes C., Roger E. Spore germination increases allergen release from Alternaria // J. Allergy Clin.Immunol.-2001.-Vol.107, №2.-P.388 -390.
38.   Green B.J., Mitakakis T.Z., Tovey E.R. Allergen detection from 11 fungal species before and after germination // J. Allergy Clin.Immunol.-2003.-Vol.111, №2.-P.285 -289.