Проблемы медицинской микологии-1999.- Том.1,№1 - С. 51-56.

МИКРОБИОТА ПРИРОДНОЙ АССОЦИАЦИИ
“ТИБЕТСКИЙ РИС”

© Н.П. Елинов, О.Г. Ларина

НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Санкт- Петербургской медицинской академии последипломного образования, Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, Россия

MICROBIOTA OF NATURAL ASSOCIATION
“TIBETIC RICE”

© N . P .Y e l i n o v, O.G. L a r i n a

Kashkin Research Institute of Medical Mycology, St. Petersburg Medical Academy of Post Graduate Education and Chemico-Pharmaceutical Academy, Russia

Изучен качественный и количественный состав микробиоты в природной ассоциации “Тибетский рис”.Изолировано 12 различных микроорганизмов. На основании морфологических и биохимических свойств 6 из них были определены как лактобациллы (L. brevis, L. acidophilus, L. casei subsp. casei, L. casei subsp. casei var. alactosus, L. casei subsp. rhamnosus, L. divergens), 3 отнесены к уксуснокислым бактериям (Gluconobacter oxidans и 2 штамма Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens), а также 2 вида дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и новый вид - Candida tibetica). Лактобактерии преобладают численно над другими микроорганизмами в этой ассоциации.

Ключевые слова: Acetobacter, Candida, Gluconobacter, Lactobacillus, микробная ассоциация.

Qualitative and quantitative microbial composition of natural microbial association “Tibetic rice” has been studied. Eleven different microorganisms were isolated. On the grounds of morphological and biochemical properties six of them were identified as Lactobacilli (L. brevis, L. acidophilus, L. casei subsp. casei, L. casei subsp. casei var. alactosus, L. casei subsp. rhamnosus, L. divergens), three have been belonged to acetоbacteria (Gluconobacter oxidans and two strains of Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens), and also two species of yeasts (Saccharomyces cerevisiae, Candida tibetica) were isolated. Lactоbacteria are superior in numbers to other microorganisms in this association.

Key words: Acetobacter, Candida, Gluconobacter, Lactobacillus, microbial association, Saccharomyces.

Введение

На территории России сравнительно давно получили широкое распространение молочнокислые продукты, производимые на предприятиях молочной промышленности. Некоторые из них, например кефир, изготавливают и в домашних условиях, чтобы ежедневно располагать свежим однодневным напитком. К числу таких продуктов относят так называемый “Тибетский рис”. Точное время и место его происхождения остаются неизвестными, хотя само название с большой долей вероятности локализует географическую привязку продукта.

В научной и народной медицине молочнокислые продукты употребляют не только в качестве пищевых, но и лечебно-профилактических средств, назначаемых по специальным показаниям. Например, кефир усиливает секреторные функции слюнных желез, поджелудочной железы, моторно-эвакуаторную функцию тонкой кишки, способствует лучшему желчеотделению, повышает аппетит. Он благотворно действует на обмен веществ (белковый, витаминный) и физическое развитие детей, повышает их сопротивляемость неблагоприятным факторам внешней среды. Кефир применяют при лечении колиэнтерита, при обострении хронических холецистита и холангита. Другой молочнокислый продукт - кумыс способствует восстановлению истощенного организма, повышает жизненный тонус, стимулирует пищеварительный аппарат, интенсифицирует окислительно-восстановительные процессы, тонизирует сердечно-сосудистую систему, возбуждает дыхательный центр, регулирует секреторную и двигательную функции желудочно-кишечного тракта, способствует этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

По некоторым разрозненным наблюдениям лица, употреблявшие “Тибетский рис”, хорошо оценивали его действие на организм, однако специальные исследования по изучению микробиоты и самого продукта “Тибетский рис” не проводились до сих пор (соответствующих данных в доступной литературе мы не обнаружили).

Материалы и методы

Первоначальный образец “Тибетского риса” передан нам д. х. н. Шатаевой Л.К., получившей его из района Российского Дальнего Востока. “Тибетский рис” представляет собой округлые или овальные желеобразные гранулы размером, в среднем, 3-10 мм, с мелкобугристой поверхностью белого цвета, без какого-либо специфического запаха; в воде оседают на дно ёмкости. Эти гранулы или зерна, а также напиток (3 суточная культуральная жидкость), получаемый при выращивании нативных зерен в питательной среде, содержащей 2% стерильного цельного молока (жирность - 1,5%) и 4% сахара в стерильной водопроводной воде (среда МСВ), были объектами нашего исследования. Количество посевного материала при изготовлении напитка составляло 60 г/л. Культивирование проводили при температуре 24 ° С в анаэробных условиях под слоем питательной жидкости в бутыли ёмкостью на 1 л или более ( в зависимости от потребности).

В работе использовали следующие питательные среды: Рогоза и Шарпа в модифиции Ленцнера – среда MRS [1], дрожжевую воду с 3% содержанием этанола или глюкозы [2], среды GYP и MYP [3], Hoyerya и среду с глицерином [4], глюкозо-картофельный агар, среду Городковой, среду Сабуро [5], сусло-агар и сусло-агар с мелом [6].

Выделение микроорганизмов из культуральной жидкости и гомогенизированных в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида зерен природной ассоциации “Тибетский рис” проводили поверхностным и глубинным высевами на сусло-агар с мелом и МРС.

Видовую принадлежность бактерий определяли по Берджи [3] и с помощью планшетной биохимической тест-системы [7], а дрожжей - по Kreger-van Rij N.I.W. [8]. Биологическая активность напитка “Тибетский рис” описана ранее [9].

Результаты и их обсуждение

Нами было установлено, что в одном грамме исследуемого нативного зерна природной ассоциации находится 4-6х10⁸ колониеобразующих клеток, из которых 99% являются кислотообразующими (о чем свидетельствует формирование зон просветления вокруг колоний на сусло-агаре с мелом). После 72 часов культивирования зерен на МСВ значение pH достигает 3,35± 0,1 , биомасса зерен возрастает на 40-60%, а количество жизнеспособных клеток в культуральной жидкости достигало максимального уровня 2-3х10⁸ кл/мл. Кривые изменения прироста биомассы зерен, количества клеток и pH в напитке при культивировании “Тибетского риса” в течение 120 часов на МСВ представлены на рис. 1.

Нами выделено одиннадцать различных штаммов микроорганизмов, образующих естественную ассоциацию “Тибетский рис”: два вида дрожжей и шесть видов бактерий.

Одна дрожжевая культура на агаризованных средах через трое суток роста при температуре 24 ⁰С образует круглые гладкие, равномерно выпуклые матовые колонии белого цвета диаметром 3-5 мм, с ровным краем; в жидких средах формирует белый осадок, пленки нет, надосадочная жидкость прозрачная. В окрашенных мазках - это почкующиеся овальные клетки размером 3-5 х 6-9 мкм. На среде Городковой образуют 2-4 аскоспоры. Культура ферментирует глюкозу, галактозу, сахарозу и ассимилирует трегалозу. Данная культура отнесена нами к виду Saccharomyces cerevisiae Hansen 1883.

Вторая культура дрожжей определена нами как новый вид, описание которого приведено ниже.

Candida tibetica Yelinov et Larina sp. nov.

In agaro musti maltati, post unum mensem (ad 25⁰C) cultura albida vel pallido-cremea, plicata, mollis, opaca cum margine undulato. In aqua glucosum et peptonum et extractum fermentatum continente, post dies 3 (25⁰C) cellulae ovoideae vei prolongatae (3.5-5.0 x 8.0-12.0-18.0 mkm) polariter et lateralater gemmascentes. Post unum mensen pellicula et sedimentum praesunt. Ultrastructura parietis secut in fermentis ascomycetoideis. In agaro solanaceo cum glucoso pseudomycelium rudimentarium (typus Candida). Artrosporae, ballistosporae, chlamydosporae nullae.

Ad crescentiam vitamina externa non necessaria sunt. Fermentatio nulla. Glucosum, galactosum, sucrosum, maltosum, trehalosum (exigue), ethanolum, glycerolum (exigue), salicinum (exigue), Natrii nitris assimilantur, at non sorbosum, lactosum, melibiosum, amylum solubile, xylosum, arabinosum, ribosum, mannitolum, inositolum, acidum DL-lacticum, Natrii nitrous.

Temperatura maxima ad crescentiam: 30⁰C. Tolerantia NaCl: 6 %. Materia amyloidea iodophila non formatur. Acidum in agaro cum Calcii carbonate non formatur. Gelatina non liquescit, urea non hydrolysatur.

Typus: KRIMM St.Ptsb Y-10T, isolatus e associatione naturali “Tibetus oryza”, in collectione microorganismorum Kashkin Res. Inst. Med. Mycology (St. Petersb. Rossia) depositus est.

Колонии (1 мес, 25 ⁰С) на сусло-агаре: белые или бледно-кремовые складчатые пастообразные матовые, край волнистый. Через 3 суток (25 ⁰С) роста в глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом полярно- или односторонне почкующиеся овоидные или удлиненные клетки, 3,5-5,0 х 8-12 мкм, некоторые до 18 мкм (рис 2.) Ультраструктура клеточной стенки (наблюдение с помощью трансмиссионного электронного микроскопа двухслойная - аскомицетовый тип (рис 3.). Культура через месяц формирует пленку и осадок, т.е. является факультативным анаэробом. На глюкозо-картофельном агаре образует рудиментарный псевдомицелий (тип Candida). Аскоспоры, балистоспоры, хламидоспоры не образует.

Сахара не сбраживает; ассимилирует: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу (слабо), этанол (слабо), салицин (слабо), натрия нитрат, не ассимилирует - сорбозу, лактозу, мелибиозу, растворимый крахмал, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, маннит, инозит, D,L-молочную кислоту, натрия нитрит. Растет в безвитаминной среде. Максимальные для роста (сусло-агар): температура – 30 ⁰С , концентрация натрия хлорида в среде - 6%. Крахмалоподобных веществ не синтезирует. Кислотообразование на меловом агаре отсутствует. Желатин не разжижает, мочевину не гидролизует.

Культурально-морфологические особенности бактерий приведены в табл. 1. Грамположительные, неспорообразующие, каталазоотрицательные изоляты были отнесены к роду Lactobacillus Beijerinck 1901; они продуцировали молочную кислоту на среде с глюкозой по гомо- или гетероферментативному типу. Характеристика и идентификация лактобацилл приведены в табл. 2. Только два типа культур 1 и 3-5 окисляли глюкозу с выделением СО₂ и являлись облигатно-гетероферментативными. Данные культуры не росли при температуре 45 ^оС, образовывали аммиак из аргинина, но по разному сбраживали углеводы. Изолят 1-го типа был определен как Lactobacillus brevis (Orla-Jensen, 1919) Bergey, Breed, Hammer, Huntoon, Murray and Harrison (1934), а 3-5 тип был отнесен к L. divergens Holzapfel and Gerber (1984), он в отличие от представителей этого вида сбраживал арабинозу и не ферментировал трегалозу.

Бактерии 3-го, 3-1-го и 3-2-го типов имели сходные морфологические характеристики, проявляли одинаково высокую ферментативную активность и все были отнесены к виду L. casei (Orla-Jensen, 1916) Hansen and Lessel, 1971 , с двумя подвидами. Ассоциант 3-1-го типа сбраживал рамнозу, рос при температуре 45 ⁰С и был выделен в подвид L. casei subsp.rhamnosus, Hansen 1968, а лактобацилла 3-2-го типа - в подвид L. casei subsp. casei var. аlactosus, Mills and Lessel (1973), так как не ферментировал лактозу.

Изолят 2-го типа определен нами как L. acidophilus (Moro, 1900) Hansen and Mocquot (1970) , хотя являлся нехарактерным представителем этого вида, так как не ферментировал крахмал, не рос при температуре 45 ⁰С, медленно створаживал молоко (за 3-4 суток) с низкой кислотностью (менее 100⁰Т).

Грамотрицательные каталазоположительные бактерии эллипсоидной формы отнесены к группе уксуснокислых. Ассоцианты 4-го и 4-1-го типов, отличавшиеся между собой только цветом и консистенцией колоний ( см.табл.1), сверхокисляли этанол и были определены нами как Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens Beijerinck, 1898 (табл. 3). Изолят 5-го типа образовывал коричневый пигмент, гидроксиацетон из глицерина и кристаллы 5-кетоглутаровой кислоты (через 4-5 недель культивирования на сусло-агаре) и был идентифицирован как Gluconobacter oxydans (Henneberg) De Ley, 1961; Asai, Iizuka et Komagata, 1964 (см.табл. 3).

Основную часть микробиоты ассоциации “Тибетский рис” составляют лактобациллы, но их соотношение в напитке и в зернах несколько различно (табл. 4). Большая часть лактобиоты напитка представлена двумя лактобациллами - гомоферментативным видом L. casei и гетероферментативным видом L. divergens, на их долю приходится 90% от общего числа микроорганизмов, а количество других лактобацилл не превышает 3%. Основу зерен изучаемой природной ассоциации составляют ранее перечисленные виды лактобацилл и в меньшем количестве L. acidophilus. Число уксуснокислых бактерий в напитке приближается к 7%, а в зерне их количество около 0,045%. Самыми малочисленными представителями ассоциации являются дрожжевые культуры, которые выполняют роль поставщиков этанола - источника углерода для ацетобактерий.

Таким образом, природная симбиотическая ассоциация “Тибетский рис” включает 11 типов микроорганизмов, представленных 6 видами бактерий и 2 видами дрожжей. Бактерии, по Берги, отнесены к родам Lactobacillus (L. brevis, L. acidophilus, L. casei subsp. casei, L. casei subsp. casei var. alactosus, L. casei subsp. rhamnosus, L. divergens) среди грамположительных неспорообразующих палочек правильной формы (группа 19), Gluconobacter oxydans и 2 штамма Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens среди грамотрицательных аэробных палочек и кокков (подгруппа 4А); два вида дрожжей определены нами как Saccharomyces cerevisiae Hansen, 1883 и Candida tibetica sp. nov. Основную часть ассоциации составляют лактобациллы.

Нами установлено, что лактобациллы изученной ассоциации по разному адгезируются к эритроцитам человека in vitro - средний показатель адгезии (СПА) был наиболее высоким для штамма L. casei subsp. casei – 4,05, средним для двух других штаммов этого вида – 3,4 и 2,69 соответственно (L. casei var.alactosus 3-2 и L. casei subsp. rhamnosus 3-1), умеренным для L.brevis 1 (1,73) и пониженным для L. divergens 3-5 и L. acidophilus 2 – 0,64 и 0,61 соответственно.

Примечательно, что лактобациллы “Тибетского риса” оказались устойчивыми к амфотерицину В, ванкомицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, нистатину, полимиксину, ристомицину, стрептомицину, тобрамицину, фузидину, клотримазолу, а некоторые - дополнительно к гентамицину, оксациллину, сизомицину, тетрациклину, фурагину, цефалексину, цефаперазону, и все оказались чувствительными к клиндамицину, левомицетину, линкомицину, олеандомицину, пенициллинам, рифампицину и эритромицину. Наиболее устойчивыми к антибиотикам были L. casei и L. divergens.

Напиток “Тибетский рис” умеренно повышает активность лизоцима и выработку некоторых молекулярных компонентов иммунной системой, обладает слабым диуретическим действием. В напитке содержатся редуцирующие сахара (10± 0,2 мг/мл), общий белок (1,5± 0,3 мг/мл), молочная кислота (0,15± 0,03%); очевидно, что диапазон его практического применения может быть заметно расширен, например при мочеполовых и других заболеваниях.

Литература

1. Блохина И.Н. Методы идентификации бактерий. Учебное пособие. -Горький.: ГГУ, 1989. - С. 42-73.
2. Промышленная микробиология / Под ред. проф. Н.С. Егорова.- М.: Высшая школа, 1989.- 688 с.
3. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ. /Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - 800 с.
4. Identification methods for microbiologists/ Ed. by B.M. Gibbs and F.A. Skinner.- London - New York.: Acad. Press, 1968.- Р. 1-7, 65-77.
5. Голубев В.И., Бабьева И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей. - М.: Пищевая промышленность, 1979. - 120 с.
6. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропромиздат, 1990.- 240 с.
7. Лихачева А.Ю., Соколова К.Я., Леванова Г.Ф. Совершенствование видовой идентификации лактобацилл с использованием микрокультуральных тест-систем и данных о строении геном //Журн. микробиол.- 1995. - № 5.- С. 45-48.
8. Kreger-van Rij N.I.W. The Yeasts. A Taxonomic Study. 3d ed. Elsevier Science Publishers, Amsterdam: 1984.- P.1082.
9. Ларина О.Г., Караваева А.В. Биологические свойства микроорганизмов природной ассоциации “Тибетский рис” // Мат. II Международного съезда Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: СПб., 1998.- С. 161-164.

Таблица 4
Процентное содержание ассоциантов в “Тибетском рисе”